产品介绍
激发波长 (nm): 646, 发射波长 (nm): 664
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果,请将蛋白 (抗体)必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的pH8.5缓冲液中溶解,浓度配制为 2 mg/mL。若 pH 低于 8.0,则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。蛋白浓度低于 2 mg/mL,标记效率会大大降低,为了获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
2. 染料准备
将10% DMSO稀释 CY 染料,制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存,不能反复冻融。(荧光染料溶液稳定性比较差,建议最好现配现用,或者配制少量储备液)
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量,CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例:假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY5 染料,则所需 CY5 体积为 3.48 μL,详细计算流程如下 (以 CY5 为例) :
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (CY5 ) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10-6 mmol×10 = 6.7×10-5 mmol
3) μL (CY5 ) = mmol (CY5 ) ×MW (CY5 ) / mg/μL (CY5 ) = 6.7×10-5 mmol× 519.12 mg/mmol / 0.01 mg/μL =3.48 μL (CY5)
使用方法
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 蛋白样品溶液中,轻轻摇匀混合,然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀,防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处,在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟,每隔 10–15 分钟,将反应小管轻轻颠倒几次,以充分混合两种反应物,提高标记效率。