源叶实验小课堂——WB-转膜_公司新闻_上海源叶生物科技有限公司

　　WB-转膜‌是Western Blot（WB）实验中的一个关键步骤，其目的是将凝胶电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如PVDF膜或硝酸纤维素膜）上，以便进行后续的抗体孵育和显色检测。

转膜的作用与原理

　　转膜是通过电场驱动，将凝胶中的蛋白质从凝胶迁移至固相载体上。这一过程确保了蛋白质的稳定性和免疫原性，使得抗体能够准确识别并检测目标蛋白。常用的固相载体包括 PVDF膜和硝酸纤维素膜（NC膜）。PVDF膜因其强大的蛋白结合能力和低荧光背景，成为WB实验中最常用的转印膜‌。

转膜的方法分类

转膜方法主要包括湿转法和半干转法：

湿转法‌：适用于大多数蛋白质，尤其是高分子量蛋白（>100 kDa），转膜时间长（60-90分钟），需在低温环境下进行‌。

半干转法‌：适用于低分子量蛋白（<50 kDa），转膜速度快（15-30分钟），但对缓冲液和电流要求严格，容易发热，需控制温度‌。

转膜的具体操作步骤

以湿转法为例，具体操作步骤包括：

准备转膜装置‌：将转膜夹、海绵垫、滤纸、膜浸泡在含甲醇的转膜缓冲液中10分钟（PVDF膜需用甲醇预激活30秒）‌。

组装转膜“三明治”‌：按顺序叠放阴极板海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、阳极板，用玻璃棒轻轻滚动排除气泡‌。

设置转膜参数‌：通常使用恒流模式，电流为200-300 mA，时间1-2小时，高分子量蛋白可延长转膜时间或降低电流‌。

转膜后处理‌：取出膜后用丽春红染色确认转膜效果，再用TBST洗去染料‌。

转膜过程中常见问题及解决方案

转膜后无信号‌：可能原因包括电流/时间不足、膜未激活、方向装反。对策是检查转膜装置方向，确保PVDF膜充分激活‌。

背景高或非特异性条带‌：可能原因包括膜未封闭完全、抗体浓度过高。对策是延长封闭时间（推荐5%脱脂奶粉封闭1小时），优化抗体稀释比例‌。

高分子量蛋白转膜困难‌：对策是改用0.45 μm厚的PVDF膜，延长转膜时间至2小时以上‌。

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