Anti-GFP 亲和层析介质

产品介绍

储存缓冲液：Buffer contains 0.1% ProClin 300

GFP（绿色荧光蛋白）或其突变体EGFP（增强型绿色荧光蛋白）被广泛应用于检测基因表达效率以及目的蛋白的表达和分布。GFP作为标签蛋白，其融合目的蛋白自发荧光，不需要目的基因的抗体或杂交就能知道目的基因在细胞中的定位，其他物质干扰小。Anti-GFP 亲和层析介质以重组的抗GFP纳米抗体为亲和配体，可以检测和纯化GFP、EGFP及其融合表达蛋白，不结合 BFP标签蛋白。

Anti-GFP 亲和层析介质储存在含0.1% ProClin 300的保护液中，凝胶和保护液的体积比为1:1，我司产品规格为实际凝胶的体积。

使用说明

1、样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2、缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液：50mM Tris，0.15M NaCl，pH7.4

酸性洗脱液：0.1M glycine HCl，pH3.0

中和液：1M Tris-HCl，pH8.0

3、样品纯化

3.1 柱层析

(1) 将Anti-GFP 亲和层析介质装入合适的层析柱，用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。

(2) 将样品加到平衡好的Anti-GFP 亲和层析介质中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

(3) 用10-50倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

(4) 酸性洗脱：使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱，向洗脱组分中加入洗脱体积十分之一的中和液，调节pH值至7.0-8.0，分管收集。注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-GFP 亲和层析介质在洗脱液中不要超过20min。

(5) 使用3倍柱体积的洗脱液清洗，然后用平衡液平衡至中性。

(6) 使用3倍柱体积的储存缓冲液平衡，2-8℃保存。

3.2 静态吸附

(1) 填料准备：取适量的Anti-GFP 亲和层析介质加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。

(2) 加入样品溶液，4℃或室温震荡孵育至少30min (不能磁力搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。

(3) 孵育完毕后，将填料混合液离心（5000×g离心1min）或过滤收集填料。

(4) 将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。

(5) 用酸性洗脱液洗脱。

(6) 填料再生和保存参考3.1中(5)和(6)。

3.3 免疫沉淀操作流程

(1) 填料准备：取40µL的Anti-GFP 亲和层析介质 (柱体积20µL) 混合液加入到1.5mL离心管中，5000×g离心1min，吸弃上清。

(2) 填料加入0.5mL平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），5000×g离心1min，吸弃上清。重复一次。

(3) 加入200-1000µL样品到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少1小时（对于易降解的蛋白，建议使用蛋白酶抑制剂，并在2-8℃层析柜中操作，冷库亦可）。5000×g离心1min，吸弃上清，小心不要吸走填料。

(4) 洗杂：加入0.5mL的洗杂液，悬浮填料，轻轻混匀，5000×g离心1min，吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。

(5) 样品洗脱：可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A 酸性洗脱：加入100µL的酸性洗脱液，悬浮填料，室温孵育5min。5000×g离心1min。小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。洗脱样品放置4℃，长时间放置-20℃保存。

B 变性洗脱：实验室常规蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）中含有β-巯基乙醇和DTT，可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使介质配体变性，洗脱后的Anti-GFP 亲和层析介质没办法重复使用。

每管中加入20µL 2×Loading Buffer，95℃加热5min。5000×g离心1min，吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测。

问题及解决方案