内毒素去除亲和层析介质

产品介绍

储存缓冲液：20% (v/v) Ethanol

本产品是一款应用于内毒素去除的琼脂糖凝胶填料，配基为多粘菌素B（Polymyxin B），能保持较高的分辨率和重力流速。

多粘菌素 B 能够特异性地结合革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS），在温和条件下可高效结合内毒素，去除率高且样品回收率高。经内毒素去除介质纯化后，蛋白溶液中的内毒素含量可降低至0.1~0.25 EU/mL。填料可耐受不同 pH、离子强度的缓冲体系，可应用于生物制药、蛋白纯化以及其他生物制品的内毒素去除工艺。

注：

① 90%体积以上的微球在此粒径范围；

② 推荐流速是指该流速充分的接触时间；

③ 10cm柱高下的最大测试流速。

④ 内毒素结合能力 (~2000000 EU/mL) 的测定需满足：原始样本内毒素浓度达到一定的检测阈值；且结合效率与内毒素含量呈正相关，相关参考数据见下表。

使用说明

1、色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定体积。内毒素去除介质的压缩比为1.20。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

2、柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

柱效测定可以采用丙酮或者NaCl作为样品进行，按照下表配制样品溶液和流动相。

根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度（HETP）、理论塔板数（N）和非对称因子（As），公式如下：

HETP = L / N

N = 5.54 × (Vʀ / Wₕ)²

As = a / b

其中：L为柱高； Vʀ为保留体积；Wₕ为半高峰宽；a为在10%峰高处的第一个半峰宽；b为在10%峰高处的第二个半峰宽。

一般来说，HETP的数值应小于填料平均粒径的三倍（即HETP/D50<3，D50为填料的平均粒径），As应在0.8~1.5之间。

3、再生

通常在使用首次使用前和每次使用后对填料进行再生，以确保填料的内毒素含量尽可能低。

常用的再生溶液为1% Triton X-114（使用温度：2~8℃）或者1% DOC（脱氧胆酸钠）。可用5~10个柱体积的溶液对色谱柱进行再生，再生后用5~10个柱体积无热源的缓冲液再平衡色谱柱。

4、平衡与上样

实验中使用的水、缓冲液和耗材均需经过无热原处理，以防止在操作过程中引入内毒素。

缓冲液与产物体系尽可能保持一致，例如20 mM PB，150 mM NaCl，pH 7.0~7.4是较为常用的缓冲体系。建议pH的范围为7~8，NaCl的浓度范围为150 mM～500 mM，以降低非特异性吸附和蛋白与内毒素之间的静电作用。

在上样前，需用缓冲液在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体积的缓冲液，以电导、pH等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。

在足够的接触时间条件下，上样体积与填料体积比通常在1~100，更大的上样体积有利于提高回收率。上样后收集流穿中的目标蛋白。

可根据实际需求再上样1~3次。

5、填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~8℃为宜，不可冻存。