EdU细胞增殖检测试剂盒 (6-FAM)

产品介绍

细胞增殖检测广泛应用于细胞活性、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的评价中, 直接检测细胞中的DNA合成被认为是最精确的检测细胞增殖的方法。EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine), 中文名为5-乙炔基-2’-脱氧尿苷, 是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷, thymidine)类似物, EdU可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide AF 488、Azide AF 555、Azide AF 594、Azide AF 647 等)通过一价铜离子的催化发生共价反应, 形成稳定的三唑环, 该反应非常迅速, 被称作点击反应(Click reaction)。通过点击反应, 新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记, 从而可以使用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞。

使用方法

1. 准备工作

(1) Click Additive Solution 的配置: 对于50T规格的试剂盒, 取12.5 mL预冷的去离子水加入到管中, 混匀至全部溶解, 即为Click Additive Solution ; 对于100T规格的试剂盒, 取25 mL预冷的去离子水加入到管中, 混匀至全部溶解, 即为Click Additive Solution; 对于200T规格的试剂盒, 取50 mL预冷的去离子水加入到管中, 混匀至全部溶解, 即为Click Additive Solution。配置后适量分装, 并于-20°C 保存。如果溶解后有白色物质析出, 请上下颠倒多次, 待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色, 说明该组分的有效成分已失效, 请弃用。

(2) Click Reaction Buffer 首次溶解后, 根据每次样本数量适量分装, 并于-20°C 保存；

2. EdU标记细胞

推荐EdU终浓度为10μM(1×)。用细胞培养液1:500稀释EdU(10mM)即可得到2×EdU工作液(20μM)。将37℃预热的2×EdU工作液(20μM)与等体积细胞悬液混合使EdU终浓度变为1×。37℃培养箱培养2小时。细胞培养基, 细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果, 因此EdU 的标记浓度和标记时间应根据所用的细胞类型做相应的优化选择。

3. 固定与通透

(1) 收集细胞, 300×g离心5min, 用含2% FBS的 PBS 溶液清洗细胞2次。
(2) 用4%多聚甲醛溶液固定细胞, 充分混匀后室温避光孵育15min。
(3) 收集细胞, 300×g 离心5min, 清洗细胞2次。
(4) 加入含0.1% TritonX100的 PBS 溶液重悬细胞, 混匀后室温孵育15min。
(5) 300×g 离心5 min, 清洗细胞2次。

4. 荧光标记

(1) 本说明书按照按照每2×106细胞500μL 的反应体系。可根据实验样本情况调整 Click 反应液的用量。
(2) 300×g 离心5 min, 收集细胞, 每孔加入500μL的Click 反应液, 混匀后室温避光孵育 30min。
(3) 反应结束后, 用含2% FBS的PBS 清洗细胞2次。
(4) 用含2% FBS的PBS 将DAPI Staining Solution（1000×）稀释成1×, 每个样加250μL, 室温孵育5 min。
(5) 最后再补加250μL 含2% FBS 的 PBS 溶液混匀, 上机检测。

注意事项

1. 请严格按照上表中组分顺序和体积配制 Click 反应液, 否则会影响后续实验。
2. Click 反应液需在配制后 15 min 内使用。
3.为避免荧光淬灭, 请尽快检测。