高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒（辉光高亮型）

产品介绍

高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒（辉光高亮型）提供一种高灵敏度及信号稳定的检测系统，具有更高灵敏度和发光信号稳定的特点，发光强度最高可达30万以上，半衰期最长可达5小时以上，符合高通量检测的需求。同时高斯荧光素酶（Gaussia Luciferase，185 AA，19.9 kDa）是一种分泌型萤光素酶，Gaussia Luciferase 质粒转染细胞后，大部分 Gaussia Luciferase 可以分泌到细胞外，所以本试剂盒既可以用于细胞培养上清样品的检测，也可以用于细胞裂解样品或纯化的酶的检测，特别适用于酶活性的实时研究。
Gaussia Luciferase 产生的生物发光信号原理是腔肠素（Coelenterazine）的氧化反应， 该反应不需要ATP或其他辅助因子。

使用说明：

一、自备材料

PBS；多道排枪；白色或黑色不透光培养板；化学发光仪或带发光检测功能的酶标仪。

二、检测前准备

1、预先将 Gaussia Glow-Bright Assay Buffer 放置于室温融化。

2、取出 Gaussia Glow-Bright Assay Substrate (100×) ，每次开盖前需进行短暂涡旋、低速离心。

3、Working Solution 的配制：按照检测每个样品需要50μL Working Solution的量，根据实际使用量，以100:1的比例将适量的GaussiaGlow-Bright Assay Buffer 与 Gaussia Glow-Bright Assay Substrate (100×) 混匀，平衡至室温，避光备用。例如：如果需要5mL Working Solution，则需要在5mL Gaussia Glow-Bright Assay Buffer 中加入50μL Gaussia Glow-Bright Assay Substrate。

注：

① 建议现配现用，剩余Working Solution在当次实验结束后直接舍弃，不要留存。

② 得到最佳检测结果，Working Solution配制后在1小时内进行检测。

三、检测方法

1、细胞上清样品的检测

(1) 细胞上清样品的准备：根据具体情况，收集转染含Gaussia质粒的细胞上清，平衡至室温。将样品加入到不透光培养板中用于检测，如果不能立即检测，可以将收集好的细胞上清放于-20℃保存，至少可保存一个月。

(2) 取恢复至室温的5~20μL细胞上清样品加入96孔白板或黑板。

注：

① 对于同一批样品检测，检测样品体积需统一，这样的检测数据具有更好的可比性，因为样品体积对于最终的化学发光值会产生影响。 ② 优先推荐使用5μL样品，样品体积小时化学发光更稳定。

③ 使用白色或黑色不透光的细胞培养板，减少孔间的信号干扰。

(3) 使用多道排枪向每个细胞孔中加入 50μL Working Solution。

(4) 室温（约25℃）孵育10min，使发光信号趋于稳定。

(5) 混匀后于化学发光仪或带发光检测功能的酶标仪中检测 Gaussia Luciferase活性。

2、细胞裂解样品的检测

(1) 细胞裂解样品的准备：

① 1×Cell Lysis Buffer 配制：每次使用前以 1: 4 比例将 Cell Lysis Buffer(5×) 与 ddH2O 充分混合，置于冰上备用。配制体积根据实验需求，建议现配现用。

② 去除细胞培养液，加入PBS清洗细胞，去除PBS后按照下表推荐加入适量的 1× Cell Lysis Buffer，室温下静置或振动摇晃裂解15min，吹打并收集全部细胞裂解产物用于后续检测。在光学显微镜下检查细胞是否完全溶解，如果溶解不完全，继续裂解15分钟。如果不能立即检测，可以将裂解液样品放于-20℃保存，至少可保存一个月。

(3) 使用多道排枪向每个细胞孔中加入 50μL Working Solution。

(4) 室温（约25℃）孵育10min，使发光信号趋于稳定。

(5) 混匀后于化学发光仪或带发光检测功能的酶标仪中检测 Gaussia Luciferase活性。

3、总高斯萤光素酶活性的快速检测

(1) 将含有转染Gaussia Luciferase质粒的细胞的不透光孔板平衡至室温。

(2) 向孔板内加入与培养基等体积的Working Solution。

(3) 室温（约25℃）孵育10min，使发光信号趋于稳定。

(4) 混匀后于化学发光仪或带发光检测功能的酶标仪中检测Gaussia Luciferase活性。

注意事项：

1、检测仪器选择：能够检测化学发光的仪器都适用本试剂盒的检测，但是针对相同的样品，不同检测器本底信号值和测量值均可能不同；且对于同一样本检测，不同仪器的数值不可横向比较。为防止孔间干扰，推荐使用不透明白色或黑色细胞培养板。

2、由于发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，所以应确保同组内不同样本检测条件一致。

3、酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将Working Solution以及细胞培养板平衡至室温。

4、如需同时检测多个细胞培养板，请尽量确保每个细胞板加入检测溶液后孵育时间一致，再进行数据读取，以此获得最佳的检测结果。 5、高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒（辉光高亮型）具有高发光信号及发光稳定性，发光强度最大可达30万以上。信号半衰期最长可达5小时以上。当酶表达量过低时，发光信号会降低，但信号稳定性会增强；当酶表达量过高时，信号半衰期会减少，但发光信号会增强。建议根据实际情况优化实验设计方案（如增加/减少质粒转染量），避免萤光素酶表达量过高/低。

6、Gaussia Glow-Bright Assay Substrate (100×) 配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发，有时会在初次使用时发现体积明显小于包装规格的情况，此时用无水乙醇把体积补足至包装规格，并混匀后即可使用。