过氧化氢 (H₂O₂) 含量检测试剂盒（二甲酚橙, 微量法）

产品介绍

过氧化氢（H₂O₂）是生物体内最常见的活性氧分子，是一种活性氧代谢的副产物，主要由SOD和XOD 等催化产生，由 CAT 和 POD 等催化降解。过氧化氢不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面，H₂O₂也是许多氧化应急反应中的关键调节因子。H₂O₂可以激活NF-κB 等因子，这些过氧化氢相关的信号途径和哮喘、炎症性关节炎、动脉硬化以及神经退行性疾病等许多疾病相关。H₂O₂也和细胞凋亡、细胞增殖等密切相关。

检测原理：利用H₂O₂氧化二价铁离子产生三价铁离子，然后和xylenol orange（二甲酚橙）在特定的溶液中形成紫色的产物，在580nm的OD值与H₂O₂浓度成正比，从而实现对H₂O₂浓度的测定。

检测范围：1-100 μM

灵敏度：1 μM

适用样本：动植物组织、细胞、细菌、血清（浆）、尿液

各组分在规格基础上额外提供10%的量用于进行标准曲线制作或预实验。

自备仪器和试剂

实验流程

1、试剂准备

2、标准品配制

标准曲线设置：先配制2mM H₂O₂ Standard：2μL 1M 的H₂O₂ Standard用998μL的Assay Buffer (1×) 稀释；再配制100μM H₂O₂ Standard：50µL 2mM 的H₂O₂ Standard用950μL的Assay Buffer (1×) 稀释。100μM H₂O₂ Standard，按照下表所示，进一步稀释标准品。每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。如果样本是细胞悬浮液，建议使用培养基配制H₂O₂标准品。

3、样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。当准备好进行该项实验时，将样本从-80℃拿出后，冰上解冻，但是请注意，这可能会影响样本的稳定性，实验结果可能会低于预期。如下物质会干扰检测结果，样本中应避免存在：Ferric salts，iron salts，sucrose，glucose，ascorbic acid，SDS (>0.2%)，sodium azide。

3.1 动物组织：

用冷的PBS清洗组织，尽可能去除血液。吸干组织上的水分，称取0.1g，加入1mL预冷的 Assay Buffer (1×)，将样本冰浴匀浆。10000g，4℃离心5min，取上清液置冰上待测。

3.2 植物组织：

称取约0.1g样本，加入1mL预冷的Assay Buffer (1×) 捣碎，冰浴超声破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），10000g，4℃离心5min，取上清液置冰上待测。

3.3 细胞（菌）：

收集5×10⁶ 个细胞或细菌，用冷PBS清洗细胞或细菌后，加入1mL预冷的Assay Buffer (1×) 冰浴匀浆或冰浴超声破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。10000g，4℃离心5min，取上清液置冰上待测。

3.4 血浆、血清和尿液（和其他生物体液）：

去除蛋白后，取上清。去除蛋白的方式：可使用10kDa的超滤管过滤后取滤液或是将样本：30% ZnSO₄溶液=20:1进行混合后涡旋，再10000g室温离心5min，取上清。

4、实验步骤

4.1 酶标仪准备：预热30min以上，调节波长到580nm。

4.2 检测体系配制：

4.3 反应体系充分混匀后在37℃孵育10min。

4.4 吸光度检测：在580nm处读取吸光度值，分别标记为A 空白 、A 标准 和A 测定 。

5、结果计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。

5.1 数据处理

计算ΔA 标准 =A 标准 -A 空白 ，ΔA 测定 =A 测定 -A 空白 。

5.2 标准曲线绘制

以标准品浓度为y轴，ΔA 标准 为x轴，绘制标准曲线。将ΔA测定代入方程得到y值 (µM)。

5.3 样本H₂O₂浓度计算

(1) 按样本质量计算

H₂O₂含量 (nmol/g 鲜重)=y×V 样 ÷(W×V 样 ÷V 样总 )×n=y÷W×n

(2) 按细胞或细菌数量计算

H₂O₂含量 (nmol/10⁴)=y×V样÷(500×V样 ÷V 样总 )×n=y÷500×n

(3) 按液体体积计算

H₂O₂含量 (nmol/mL)=y×V 样 ÷V 样 ×n=y×n

参数说明

nmol：1 μM=1 nmol/mL；

V 样 ：加入样本体积；

V 样总 ：加入Assay Buffer (1×) 体积，1mL；

n：样本稀释倍数；

W：样本质量，g；

500：细胞或细菌数量，以10⁴为单位。

6、结果展示

典型标准曲线：y=207.21x+1.4921, R²=0.9988

示例-1：取0.1g玉米组织，按照测定步骤操作，用96孔板进行检测。测得ΔA 测定 =A 测定 -A 空白 =0.278-0.048=0.230， 代入标准曲线，计算y=49.15。按样本质量计算得：H₂O₂含量(nmol/g)=y×V 样 ÷(W×V 样 ÷V 样总 )×n=y÷W×n=491.5 nmol/g。

注意事项

1、正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

2、本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。

3、建议实验者自行建立标准曲线以提高结果准确度。如未自行建立标准曲线，可参考结果展示部分的典型标准曲线公式进行结果计算。

4、生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。

5、本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

常见问题及解答
Q：检测得到的样本ΔA测定过高或者过低怎么办？
A：如果样本ΔA 测定 ＞浓度为100µM标准品的ΔA标准，则说明样本H₂O₂含量太高，需用Assay Buffer (1×) 适当稀释（计算公式中乘以相应稀释倍数）。如果样本的ΔA 测定 ＜0.005，可提高样本量。