己糖激酶 (HK) 活性检测试剂盒 (WST-8, 微量法)

产品介绍

己糖激酶（HK，EC2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

检测原理：HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖 脱氢生成NADH，生成的NADH将WST-8还原生成橙黄色的formazan（甲臜），在450nm左右检测有最大吸收峰。通过检测450nm处光吸收增加速率即可计算出样本中HK活性。

检测范围：31.25-2000 μM

灵敏度：31.25 μM

适用样本：动植物组织、细胞、细胞上清、细菌、血清（浆）

自备仪器和试剂

实验流程

1、试剂准备

2、标准品配制

使用去离子水将浓度为2000μM的标准品稀释为1000μM、500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM的标准溶液。每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

3、样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。

3.1 动物组织样本：

称取约0.1g样本，加入1mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。

3.2 植物组织样本：

称取约0.1g样本，加入1mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声破碎5min（功率20%，超声3s，间隔7s，重复30次），8000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。

3.3 细胞（菌）：

收集5×10⁶个细胞或细菌到离心管内，用预冷的PBS清洗，离心后弃上清。加入1mL Extraction Buffer，冰浴超声破碎5min（功率20%，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。 

3.4 细胞上清或血清（浆）：

直接检测。

4、实验步骤

4.1 酶标仪准备：预热30min以上，调节波长到450nm。 

4.2 测定工作液的配制：

测定孔每孔配制190µL测定工作液：吸取183µL Substrate Mix，1µL Enzyme Mix，5µL WST-8，1µL Enhancer。测定工作液需现配现用。 

4.3 对照工作液的配制：

对照孔每孔配制190µL对照工作液：吸取184µL Substrate Mix，5µL WST-8，1µL Enhancer。对照工作液需现配现用。 

4.4 检测体系配制：

空白孔在96孔板中依次加入10μL去离子水和190μL测定工作液；

标准孔在96孔板中依次加入10μL不同浓度的标准品和190μL测定工作液；

测定孔在96孔板中依次加入10μL样本和190μL测定工作液；

对照孔在96孔板中依次加入10μL样本和190μL对照工作液。

注意：每个样本设置一个对照孔，消除样本本身颜色的干扰。 

4.5 反应体系充分混匀后，室温孵育5min。 

4.6 吸光度检测：在450nm处读取吸光度值，分别标记为A 空白 、A 标准 、A 测定 和A 对照 。 

 5、结果计算 以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。 

5.1 数据处理 计算ΔA 标准 =A 标准 -A 空白 ，ΔA 测定 =A 测定 -A 对照 。 

 5.2 标准曲线的绘制 以标准液浓度为y轴，ΔA 标准 为x轴，绘制标准曲线。将ΔA 测定 带入方程得到y值 (1µM=1nmol/mL) 即NADH含量。 

 5.3 样本HK活性计算 

 (1) 按样本质量计算 

 单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 HK (U/g 鲜重)=y×V 标准 ÷V 样 ×V 提取 ÷W÷T=0.2×y÷W 

 (2) 按细胞或细菌数量计算 

 单位的定义：每10⁴个细胞或细菌每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 HK (U/10⁴)=y×V 标准 ÷V 样 ×V 提取 ÷500÷T=0.0004×y 

 (3) 按液体体积计算  

单位的定义：每毫升液体每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 HK (U/mL)=y×V 标准 ÷V 样 ÷T=0.2×y 

 (4) 按蛋白浓度数量计算 

 单位的定义：每mg蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 HK (U/mg prot)=y×V 标准 ÷V 样 ÷Cpr÷T=0.2×y÷Cpr

 参数说明 

 1 μM=1 nmol/mL； 

 V 标准 ：加入标准品体积，0.01mL； 

 V 样 ：加入样本体积，0.01mL； 

 V 提取 ：加入Extraction Buffer 体积，1mL；

W：样本质量，g；

T：反应时间，5min；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

500：细胞或细菌数量，5×10⁶，以10⁴为单位。

6、结果展示

典型标准曲线：y=1304.2x+5.7163，R²=0.9999

示例：取0.1g小鼠肌肉组织，按照测定步骤操作，用96孔板进行检测。测得：ΔA 测定 =A 测定 -A 对照 =0.562-0.065=0.497。将ΔA 测定 代入标准曲线方程，得到y=653.9037。按样本质量计算得：HK (U/g鲜重)=y×V 标准 ÷V 样 ×V 提取 ÷W÷T=0.2×y÷W=1307.81 U/g。  

注意事项

1、正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

2、本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。

3、对于组织样本及细胞样本等，可通过测定蛋白浓度来进行样本间结果均一化。推荐使用阿拉丁B665595 BCA蛋白定量试剂盒或R1491648 即用型BCA蛋白定量试剂盒。

4、建议实验者自行建立标准曲线以提高结果准确度。如未自行建立标准曲线，可参考结果展示部分的典型标准曲线公式进行结果计算。

5、生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。

6、本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。 

常见问题及解答 

Q：检测得到的样本ΔA 测定 过高或者过低怎么办？ 

A：如果样本的ΔA 测定 ＞1.5，则说明样本HK活性太高，需用Extraction Buffer适当稀释，再重新进行测定。如果样本的ΔA 测定 ＜0.001，可提高样本量，再重新进行测定。