无机磷含量检测试剂盒（米吐尔钼蓝, 比色法）

产品介绍

血清中的无机磷（Inorganic Phosphorus）主要由H₂PO₄⁻和HPO₄²⁻两种磷酸根阴离子组成，上述阴离子在不同的pH环境下能快速相互转换。在pH7.4血清中两种磷酸根阴离子浓度比例为1:4，在酸中毒环境下二者浓度约为1:1，在碱中毒环境下二者浓度比例为1:9，在pH4.5尿液中浓度比例为100:1。WHO推荐的常规检测方法为比色法，我国卫生部临检中心推荐的常规方法为硫酸亚铁钼蓝比色法和米吐尔钼蓝比色法。检测原理：利用无机磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵，后者被米吐尔还原成蓝紫色的复合物，通过分光光度计测定650nm处吸光度，根据公式计算出无机磷含量。本试剂盒仅用于科研，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备仪器和试剂

1、去离子水

2、电子天平、离心管或试管、水浴锅或恒温箱或金属浴、比色杯、分光光度计

实验流程

1、制备样品

1.1 血浆、血清样品按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于Pi的检测。

1.2 细胞或组织样品取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-20℃冻存，用于Pi的检测。

1.3 高浓度样品如果样品中含有较高浓度的Pi，可以蒸馏水稀释。

注：样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的Pi含量，推荐使用阿拉丁B665595 BCA蛋白定量试剂盒或R1491648 即用型BCA蛋白定量试剂盒。

2、配制磷标准工作液取适量的磷标准 (1mg/mL)，按磷标准 (1mg/mL)：标准品稀释液=1:99的比例稀释，即获得磷标准工作液 (10μg/mL)，-20℃冻存，用于Pi的检测。

3、配制钼酸铵溶液将钼酸铵粉末和钼酸铵稀释液按0.3g：50ml的比例混合，充分溶解，不好溶解时可采取超声助溶。配好的钼酸铵溶液应4℃避光保存，1个月有效。

4、配制米吐尔溶液将50mg米吐尔溶解于25ml去离子水中，再将米吐尔水溶液和米吐尔稀释液按1:9的比例充分混合。配好的米吐尔溶液应4℃避光保存，1个月有效。

5、Pi加样按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡，小心混匀。如果样品中的无机磷浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置2平行管，求平均值。加入物 (ml)空白管标准管测定管ddH₂O0.5——磷标准工作液 (10μg/mL)—0.5—待测样品——0.5钼酸铵溶液0.50.50.5米吐尔溶液0.50.50.5沸水浴煮沸30min，各管加去离子水1ml，水中冷却至室温。

6、Pi测定比色杯光径1.0cm，以空白调零，分光光度计650nm处测定各管吸光度（即为A标准，A测定）。

7、结果计算血清、血浆中无机磷计算公式：磷=(A测定/A标准)×0.323×N (mmol/L)=(A测定/A标准) ×10×N (mg/L)组织中磷

计算公式：磷 (mmol/mg)=(A测定/A标准)×0.323×N/c

参数说明：

A测定：待测管的吸光度，A标准：标准管的吸光度，N：样本稀释倍数，c：待测样品蛋白浓度(mg/L)单位换算：1 mg/dL=10 mg/L=10μg/mL=0.323mmol/L 

参考区间：样本血清磷浓度健康成年人0.96~1.62mmol/L (3~5mg/dl)儿童1.45~2.1mmol/L (4.5~6.5mg/dl)

附录1：利用本法检测血清白蛋白比值倒置的样品时，易导致浑浊，可对样品进行去蛋白处理。

操作如下：取0.1ml待测血清，加入0.9ml Pi去蛋白试剂，充分混匀，低速离心，取上清液0.05ml。磷标准工作液 (10μg/mL) 同样进行处理，其余同上述操作。

附录2：参考标准曲线范围：分光光度计650nm测定磷标准在10μg/mL时的吸光度多在0.3~0.6之间（以空白调零）。按说明书要求操作并测定磷标准在0、1、5、10、15、20、25、30μg/mL时的吸光度。

注意事项

1、配好的钼酸铵溶液和米吐尔溶液应尽快使用，放置过久会导致正常血清液产生轻度浑浊，如试剂变蓝则不能使用。

2、如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。

3、生成蓝色的深浅与pH、时间和温度有密切关系，需仔细控制显色条件。

4、本法的线性范围为1~35μg/mL。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。