线粒体活性氧 (ROS) 产生速率检测试剂盒（荧光法）

产品介绍

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）是氧正常代谢的天然副产物，包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟 化物等，研究表明，机体95％以上的活性氧（ROS）都来自于线粒体，其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态，细胞内活性氧（ROS）水平维持在较低的生理范围；在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破，细胞内活性氧水平过多，就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，同时，活性氧还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。

线粒体活性氧 (ROS) 产生速率检测试剂盒 (荧光法) 提供了一种简单、灵敏、快速的线粒体ROS产生速率检测方法，其原理是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，DCFH-DA (2',7'-二氯荧光素二乙酸酯) 可扩散通过线粒体膜，并在线粒体内被酯酶水解形成无荧光的DCFH，DCFH被活性氧（ROS）氧化生成有荧光的DCF，DCF荧光强度增加速率与ROS产生的速率呈正比。

适用样本：动植物组织、细胞、真菌

荧光激发/发射：Ex/Em=488/525nm

注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备仪器和耗材

可调节式移液枪及枪头

匀浆器、低温离心机、96孔全黑酶标板或全白酶标板

恒温培养箱、多功能酶标仪

实验流程

1、试剂准备

2、样本制备

组织、细胞线粒体提取： 

2.1 称取约0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL Extraction Buffer和10µL Reagent Ⅱ，匀浆器冰浴匀浆，600g，4℃离心5min，收集上清至新的离心管中，舍弃沉淀。

2.2 再次离心上清，11,000g，4℃离心10min，沉淀即为提取的线粒体。 

2.3 弃上清，沉淀加入200µL ReagentⅠ重悬，置于冰上待测。 

注意：

(1) 建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。 

(2) 提取好的线粒体样本需要在当天检测完，不可冷冻保存。 

(3) 如需测定蛋白浓度，推荐使用阿拉丁 B774074 Bradford蛋白浓度测定试剂盒或B406195 Bradford测定溶液 (即用型) [蛋白质测定用]。

3、实验步骤

3.1 多功能酶标仪预热到37℃，调节荧光激发波长488 nm，发射波长525 nm。

3.2 在96孔全黑酶标板或全白酶标板按照如下方式加样：

3.3 混匀，37℃避光孵育15min。孵育完成后，用多功能酶标仪测定10min内的荧光值，激发波长488 nm，发射波长525 nm，仪器温度保持在37℃，记录10min内的荧光值变化。

注意：

(1) 需37℃恒温下测定10min内荧光强度变化。

(2) 用移液器混匀时，要小心吸打，避免产生气泡。 

(3) 检测时需使用全黑色或白色的96孔板，防止相邻孔的干扰。 

4、结果计算 

4.1 对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理，计算出回归系数，即直线斜率（k）。 

实际线粒体ROS产生速率等于样本荧光强度随时间变化（s）的数据点线性回归直线斜率（k测定）减去本底荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率（k空白），k=(RFU10min-RFU0min)/600。 

4.2 结果计算 

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。 

(1) 按样本质量计算： 每g组织线粒体每秒钟荧光单位的变化，即u/s/g鲜重。 

ROS产生速率 (u/s/g 鲜重) =(k测定-k空白)÷(V样÷V总×W)=100×(k测定 -k空白) 

(2) 按样本蛋白浓度计算： 

每mg蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化，即u/s/mg prot。 

ROS产生速率 (u/s/mg prot) =(k测定-k空白)÷(V样÷V总×Cpr)=10×(k测定-k空白)÷Cpr 

(3) 按细胞数量计算： 

每10⁴个细胞每秒钟荧光单位的变化，即u/s/10⁴Cells。 

ROS产生速率 (u/s/10⁴ Cells)=(k测定-k空白)÷(500×V样÷V总)=(k测定-k空白)÷50 

参数说明 

V样 ：加入样本体积，0.02 mL； 

V总 ：重悬样本总体积，0.2 mL；

W：样本质量，0.1 g；

500：细胞数量，以10⁴为单位。

注意事项

1、生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。

2、本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。