产品介绍

Rhodamine 123（罗丹明123，Rh 123）是一种常用的阳离子绿色荧光染料，可以透过细胞膜从而在活细胞线粒体内聚集，并发出黄绿色荧光，可广泛用于检测线粒体膜电位，并且对细胞没有任何毒性‌。

检测线粒体膜电位的核心原理依赖于线粒体跨膜电位（ΔΨm）的静电作用主动穿透并富集于基质：在健康细胞中，高膜电位（-150~180mV）使染料选择性聚集于线粒体内，发出黄绿色荧光（强度与膜电位正相关，激发/发射波长为507nm/529nm）；当细胞发生凋亡或坏死时，膜电位去极化导致染料释放，荧光显著减弱。

自备试剂及耗材：吸头/离心管。

实验步骤：

1.Rhodamine123染色工作液的配制：

a.6孔板每孔所需 Rhodamine 123染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的 Rhodamine 123染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5ml Rhodamine 123染色工作液。

b.取适量 Rhodamine 123 (1000X)，按照每1μl Rhodamine 123 (1000X) 加入1ml 检测缓冲液的比例稀释 Rhodamine 123，混匀后即为 Rhodamine 123 染色工作液。

注1：配制 Rhodamine 123 染色工作液时注意避光，且须现配现用，不能长期保存。

注2：本试剂盒中提供的检测缓冲液含有Ca²⁺，能够在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好；检测缓冲液也可用细胞培养液代替，但培养液中不能含有血清，否则会影响 Rhodamine 123 的染色效果。

注3：染色工作液中 Rhodamine 123 的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Rhodamine 123 的推荐工作浓度为1X，可以在0.1X-5X范围内摸索最佳工作浓度。

2.阳性对照的设置：

把试剂盒中提供的 CCCP(10mM) 推荐按照1:1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法加入 Rhodamine 123 染色工作液，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μM CCCP 处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，Rhodamine 123 染色后观察应呈弱黄绿色或几乎无荧光；而正常的细胞经 Rhodamine 123 染色后应显示明亮的黄绿色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料或自行摸索确定。

3.对于悬浮细胞：

a.细胞按照实验设计进行一定处理后，计数。取适量细胞600×g室温离心5min，弃上清，加入适当体积的 Rhodamine 123 染色工作液重悬细胞，使细胞密度约为 1×106/ml。

b.细胞培养箱中37°C孵育20-60min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以20min作为初始孵育时间，对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。

c.37°C孵育结束后，600×g室温离心5min，沉淀细胞。吸除上清，注意尽量不要触及细胞。

d.用37°C预热的细胞培养液洗涤2次：加入1ml37°C预热的细胞培养液重悬细胞，离心5分钟，沉淀细胞，弃上清；重复一次。

e.再用适量细胞培养液重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光酶标仪或流式细胞仪分析。

4.对于贴壁细胞：

注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光酶标仪或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。荧光酶标仪如果能采用底读的方式进行荧光检测，也可以使用96孔板等进行贴壁培养检测的。

a.对于6孔板的一个孔的细胞，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次。

b.加入1ml Rhodamine 123 染色工作液。细胞培养箱中37°C孵育20-60min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以20min作为初始孵育时间，对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。

c.37°C孵育结束后，吸除上清，用预热的细胞培养液洗涤2次。

d.加入2ml预热的细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

e.荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5.对于纯化的线粒体：

a.准备好 Rhodamine 123 染色工作液。

b.0.9ml Rhodamine 123 染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10-100μg纯化的线粒体。

c.用荧光酶标仪或荧光分光光度计检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(timescan)，激发波长为507nm，发射波长为529nm。如果使用荧光酶标仪，可在软件中把检测对象设置为FITC，即可以检测 Rhodamine 123。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。

d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

6.荧光观测和结果分析：

Rhodamine 123 的最大激发波长为507nm，最大发射波长为529nm。如使用荧光显微镜观察，可以参考观察FITC等其它绿色荧光时的设置。黄绿色荧光变弱说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。通过对比实验组与阴性对照组测量的Relative Fluorescence Units (RFU)，可以得出药物处理后线粒体内Rhodamine123探针荧光强度的变化。此处的阴性对照为仅含检测缓冲液的未经染色的细胞样品。

注：流式检测应获得两个相对独立的细胞群：明亮绿色荧光的正常细胞群和弱绿色荧光的凋亡或坏死细胞群。

注意事项：

1.荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.本试剂盒仅限于用于存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

3.检测缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果检测缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。

4.CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

5.荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，建议使用96孔黑板。

6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。