AF350抗体标记试剂盒

产品介绍

荧光染料抗体标记试剂盒设计注重效率与可靠性，可在60分钟内快速完成标记，仅需极少的人工操作时间。试剂盒内含抗体标记所需的所有试剂，包括NHS酯活化染料、缓冲液和脱盐柱。试剂盒中的活性染料可与抗体或蛋白质中的赖氨酸残基高效结合，生成共价连接的荧光传感器。配套的脱盐柱可去除过量未反应的染料，回收率可达70%-95%。试剂盒提供5管活性染料，每管活性染料都含有优化量的染料，可实现100μg抗体的标记反应。我们提供多种颜色染料试剂盒，包可兼容多种检测系统，包括荧光显微镜和流式细胞术。产品组分A1491932Component 5 reactionsStorageQuantity Per ReactionA1491932AAF350 NHS Ester5 vials-20℃. Store in the dark. 1 vial for labeling 100 μg of antibodyA1491932BNaHCO3100 mgRT.Prepare according to instructionsA1491932CSpin Desalting Column5 EA2-8℃. Do not freeze.1 EA for 1 reactionA1491932DCollection Tubes10 EART.2 EA for 1 reaction其他所需试剂1. 离心机2. 用于标记的所需抗体（不含BSA或任何载体蛋白）。3. PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）。重要须知1. 纯化的抗体缓冲液中不得含有铵离子或者伯胺组分，例如Tris、甘氨酸、乙醇胺、三乙胺、谷胱甘肽或咪唑，所有这些物质都会显著抑制蛋白质标记。2. 用于标记的抗体需经过纯化，不含有BSA或明胶等稳定剂。3. 抗体浓度1-2mg/mL最佳，浓度低于1mg/mL, 标记效率可能会降低，浓度过高，抗体体积会过少，不利于纯化回收。4. 脱盐柱建议一次性使用。5. 试剂盒使用之前，需将所有组分恢复至室温。6. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光的淬灭。使用说明1. 缓冲液配制：a) 1M NaHCO₃的配制。根据样品量配制适量的1M NaHCO₃溶液，如称取42mg NaHCO₃，加入0.5mL超纯水即得1M NaHCO₃溶液。NaHCO₃可维持标记反应体系的pH在7-9之间，提高标记效率。注：NaHCO₃溶液须现用现配。2. 抗体标记a) 如果待标记的抗体浓度≥1mg/mL，并且在适当的缓冲液中，则将其稀释至1mg/mL，并加入10%抗体体积的1M NaHCO₃缓冲液。如果抗体是从适当的缓冲液中冻干的粉末，通过向抗体中加入适量的0.1M NaHCO₃缓冲液来制备1mg/mL的抗体溶液。用去离子水将1M溶液稀释10倍，制备0.1M NaHCO₃缓冲液。b) 将100μL抗体溶液转移到活性染料管中。盖上管盖，轻轻翻转几次，使染料完全溶解。注意：为确保染料完全溶解，请将标签从活性染料管上撕下。c) 将反应管室温避光反应1h。反应可以在振荡器或混合器上进行，建议上下翻转速度为25rpm。如果在反应过程中不使用混合仪器，则应每10分钟将反应溶液倒置混合一次。注意：反应进行期间，可提前进行步骤3的操作，完成脱盐柱的平衡。3. 脱盐柱预平衡a) 松开脱盐柱盖子，折断柱子下端堵头，将脱盐柱置于配套的2mL收集管中。1000xg离心2分钟，丢弃离心下来的保存溶液，并将脱盐柱放回收集管中。注意：使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。b) 向脱盐柱树脂顶部加入500μL PBS，轻轻拧上脱盐柱上盖，1000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复此步骤3次。4. 荧光标记抗体纯化a) 将平衡后的脱盐柱转移至新的收集管中。小心的将反应管中的反应液加入脱盐柱中，盖上脱盐柱盖子，注意盖子轻轻拧上即可。b) 脱盐柱1000xg离心2分钟，收集管中的流出即为所需收集的抗体偶联物。5. 测定蛋白质浓度和DOL（可选）DOL（标记度）是衡量荧光标记效率的关键参数，表示荧光团与目标分子（如抗体或蛋白质）的摩尔比。可以从抗体偶联物的吸收光谱中测定。a) 检测标记产物280nm的吸光度（A₂₈₀）和对应染料最大吸收波长处的吸光度（Adye）。不同染料的参数可参考下面表格。Cat.No.Dyesλmax (nm)Em (nm)εdye (M⁻¹cm⁻¹)CF₂₈₀Target DOLMW (g/mol)A1491932AF35034344119,0000.194-9410A1491933AF40540142234,0000.74-91028A1491934AF48849052576,0000.14-91081A1491935AF53253055581,0000.094-9723A1491936AF555553568150,0000.084-81250A1491937AF59459061892,0000.564-9820A1491938AF647650668239,0000.034-81300A1491939AF660663691132,0000.13-81100A1491940AF680681704184,0000.053-71150A1491941AF700696719192,0000.073-71400A1491942AF750752776240,0000.043-81300F1491944FITC 49851773,0000.353-8389P1491945Pacific Blue41045546,0000.24-9339O1491947Oregon Green 48849852676,0000.123-8509T1491948TRITC557576100,0000.341-3443C1491949Cy3554566150,0000.073-5734C1491950Cy5647665250,0000.033-5754b) 计算抗体偶联物中抗体浓度：抗体浓度（mg/mL） = (A₂₈₀ - CF₂₈₀× Adye) / 1.4c) 计算DOL:DOL = (Adye / εdye) / [(A₂₈₀ - CF₂₈₀ × A₂₈₀) / 210,000]注意：1. 典型的IgG抗体在280nm处的摩尔消光系数为210,000 MM⁻¹cm⁻¹。2. Adye 是指染料在最大吸收波长处的吸光度值。3. CF₂₈₀ 指染料在280nm处的校正系数。6. 保存a) 向标记后的蛋白中加入 0.05~0.2 % Proclin 300 或 0.05 %叠氮化钠，及蛋白稳定剂 (如 0.1 % BSA)，于 2~8°C 避光保存，可稳定保存半年。或加入等体积甘油于-20°C 存储，可稳定保存半年。