产品介绍

细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与Cy-dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。 本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。 

组分：

使用方法：

实验材料（自备）

.PBS 缓冲液（1×, pH~7.4）

.0.2% Triton X- 100（PBS 配制）

.0.1% Triton X- 100（PBS 配制，其中含 5 mg/mLBSA）

.4%多聚甲醛（PBS 配制）

.免疫组化笔

.脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

.石蜡切片处理相关试剂

.抗荧光淬灭封片剂

.ddH2O

实验设计

.A. 阳性对照：

DNaseI 处理制备阳性对照载玻片。 DNaseI 可以消化单链或双链 DNA 暴露 3'-OH 末端，人为造成细胞凋亡。 每次实验做一次即可。（用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题）

.B. 阴性对照：

使用不含 TdT Enzyme 的 TUNEL Reaction Buffer，用 ddH2O 替代 TdT Enzyme 。 （主要是排除细胞自身凋亡、操作过程等原因导致的非特异性染色； 以及调整拍摄曝光强度。）

.C. 实验处理组。

实验组按照说明书正常操作。

.D. 实验对照组。

实验组按照说明书正常操作。

实验步骤

1. 样本准备：

（1）对于贴壁细胞或细胞涂片

a. PBS 清洗 1 次。

注：如果担心细胞涂片的细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

b. 固定： 加入适量 4%多聚甲醛（PBS 配制）， 4℃固定 30 min 。PBS 清洗 2 次。

c. 通透： 加入适量 0.2% Triton X- 100（PBS 配制），室温通透 20 min 。PBS 清洗 2 次。

d. 转步骤 2. TUNEL 反应。

（2）对于悬浮细胞或细胞悬液

a. 收集细胞（ 3-5×106 个细胞），1000 rpm 离心 5 min ，PBS 清洗 2 次。

b. 固定： 加入适量 4%多聚甲醛（PBS 配制）充分重悬细胞， 4℃固定 30 min 。2000 rpm 离心 5 min ，PBS 清洗 2 次。

c. 通透： 加入适量 0.2% Triton X- 100（PBS 配制），室温通透 20 min 。2000 rpm 离心 5 min ，PBS 清洗 2 次。

d. 转步骤 2. TUNEL 反应。

（3）石蜡组织切片

a. 脱蜡与水化： 将切片样本依次放入二甲苯 I（10 min）→ 二甲苯 II（10 min）→ 100％乙醇 I（5 min）→ 100％乙醇 II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O 冲洗 5 min ，冲洗 2次。

注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

b. 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。

注：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。

c. 通透： 按 1: 100 的比例，将 2 mg/mL 的 ProteinaseK 溶液用 PBS 稀释至终浓度 20 µg/mL，在每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域， 20-37℃孵育 20 min。

注： Proteinase K 可通透细胞膜和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核进行反应，提高标记效率。孵育时间过 长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险， 过短则可能造成透性处理不充分， 影响标记效率。为得到更好的结果， Proteinase K 的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。

d. PBS 清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

注：这一步必须把 Proteinase K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

e. 转步骤 2. TUNEL 反应。

（4）冰冻组织切片

a. 固定： 取出冰冻切片，并回温至室温。加入适量 4%多聚甲醛（PBS 配制），室温固定 30 min 。PBS 清洗 2 次，每次 10min。

注： 若是担心甲醛清洗不干净， 影响最终染色效果。可在甲醛固定完成后加入适量 2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min，中和残留

的固定液，再进行 PBS 清洗。

b. 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。

注：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。

c. 通透： 按 1: 100 的比例，将 2 mg/mL 的 ProteinaseK 溶液用 PBS 稀释至终浓度 20 µg/mL，在每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域， 20-37℃孵育 20 min。

注： Proteinase K 可通透细胞膜和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核进行反应，提高标记效率。孵育时间过 长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险， 过短则可能造成透性处理不充分， 影响标记效率。为得到更好的结果， Proteinase K 的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。

d. PBS 清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

注：这一步必须把 Proteinase K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

e. 转步骤 2. TUNEL 反应。

（5）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤）

a. 按 1: 10 的比例用 ddH2O 将 10×DNase I Buffer 稀释成 1×DNase I Buffer 备用。

b. 滴加 100 µL 1×DNase I Buffer 到已处理的样本上， 覆盖全部样本区域，室温平衡 5 min。

c. 用 1×DNase I Buffer 以 1: 100 稀释 DNase I (2 U/μL)至终浓度 20 U/mL 的工作液。

d. 弃去 Buffer，加入 100 μL 浓度为 20 U/mL 的 DNase I 工作液，室温孵育 10 min。

e. 弃去 DNase I 工作液， PBS 清洗 2 次。

f. 转步骤 2. TUNEL 反应。

2. TUNEL 反应

（1）配制 TUNEL 反应液（即用即配） ：

（2）对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片

a.每个样本加入 50 μL TUNEL 反应液，使反应液均匀覆盖样本。 37℃避光孵育适宜的时间（细胞推荐染色时间 30 min- 1 h，组织染色时间推荐 2 h）。

注： 50 μL TUNEL 反应液适合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以适当调整 TUNEL 反应液体积，覆盖细胞即可） 。 如果待检测的样品为涂片、切片或在 24 孔板、 12 孔板或 6 孔板中， 可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适 当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加 TUNEL 反应液后覆盖在样品上，可以防止 TUNEL 反应液蒸发，并且使TUNEL 反应液均匀覆盖样本。

b. 弃去 TUNEL 反应液， PBS 清洗 2 次后， 再用 0.1% Triton X- 100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）清洗 3 次，每次 5min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。

c. （可选） 每个样本加入适量浓度为 5 μg/mL 的 DAPI 染液， 室温避光孵育 5 min。染色完成后， 弃去 DAPI 染液， PBS 清洗2 次，每次 5 min。

d. （可选） 切片封片：每个样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片剂（抗荧光淬灭封片剂可能会不适用于某些染料， 实验前建议进行预实验测试匹配性），盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

e. 用滤纸吸去多余的液体，向样本区域加 100 μL PBS 保持样本湿润，立即在荧光显微镜下观察。

（3）对于悬浮细胞或细胞悬液

a.每个样本管加入 50 μLTUNEL 反应液轻轻重悬细胞，37℃避光孵育 30~ 1 h。每隔 15 min 用微量移液器轻轻重悬细胞。

b. 2000 rpm 离心 5 min，弃去 TUNEL 反应液， 用 0.1% Triton X- 100（PBS 配制，其中含 5 mg/mLBSA）清洗 2 次，每次 5min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。

c. 每个样本管加入 100 μL 浓度为 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室温避光孵育 5 min。

d. 加入 400 μL PBS 重悬细胞，立即用流式细胞仪检测或进行涂片后在荧光显微镜下观察。

注意事项：

1.使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2.染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。

3.实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。

4.组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

5.荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品参数：

490/515nm；

应用范围：

晚期凋亡检测、TUNEL Kit