Anti-HA Magnetic Beads (Anti-HA磁珠)

产品介绍

血凝素（Hemagglutinin, HA），又称红血球凝聚素，具有良好的免疫原性，其诱导产生的抗血凝素抗体可特异性中和血凝素活性。HA标签是一段源自人流感病毒血凝素蛋白第98～106位氨基酸的短肽序列，氨基酸序列为YPYDVPDYA，分子量约1.1 kDa，是目前生物实验中广泛应用的表位标签之一。通过重组DNA技术将HA标签融合至目的蛋白的N端或C端，可有效辅助目的蛋白的亲和纯化与表达检测，且对目的蛋白天然功能的干扰较小。

Anti-HA抗体可特异性识别与HA标签融合表达的目的蛋白，广泛应用于该类融合蛋白的表达验证、细胞内定位分析，同时可用于融合蛋白的亲和纯化、定性及定量检测。本公司研发的Anti-HA抗体亲和力高、特异性强，适配Western blot（WB）、免疫沉淀（IP）等蛋白表达检测及蛋白互作相关实验。

本产品所用高聚物磁珠，采用先进高分子聚合技术将超顺磁性材料与高分子基质完美结合，兼具快速磁响应性与优异的微球分散性，同时具备极低的非特异性吸附特性及丰富的配体结合位点，可高效适配Anti-HA抗体偶联及后续HA标签融合蛋白的捕获实验。磁珠具体性能参数详见下表。

技术参数

使用方法

本操作流程主要为蛋白互作实验，每次反应使用20 μL Anti-HA Magnetic Beads，使用流程可参考图1。

图1：Anti-HA Magnetic Beads使用流程图

1. 推荐缓冲液（自备）

2. 磁珠漂洗

2.1 取20 μL混匀后的磁珠置于1.5 mL离心管中，加入500 μL洗杂缓冲液，轻柔上下颠倒混匀5–10次（勿涡旋）。

2.2 将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附（约30 s–1 min）后，吸弃全部上清（避免吸到磁珠）。

2.3 重复上述步骤4次，总计完成5次漂洗，最后一次漂洗后尽量吸尽上清，保留磁珠备用。

3. 样品孵育

3.1 向上述漂洗好的磁珠中加入500-1000 μL 的细胞裂解样品，常温或4℃下孵育60min（建议在旋转混匀仪上孵育，使样品和磁珠充分接触）。

3.2 孵育结束后，将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，将上清转移至新的离心管中，留样备检。

3.3 向离心管中加入500 μL 洗杂缓冲液，轻轻颠倒混匀5-10次后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后弃去上清。

3.4 重复操作5次。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、0.5 h-2 h或者4℃、1 h-4 h，根据实际的结合效果适当调整孵育时间，一般情况下不建议过夜孵育，过夜孵育可能会引起过多的非特异性吸附。磁珠每次洗涤，加入洗杂缓冲液后可以冰上静置3-5 min。

4. 蛋白洗脱

4.1 洗脱液洗脱

每20 μL 原始磁珠体积加入40 μL 洗脱液，常温或4℃洗脱5-10 min，期间轻轻混匀3-5次。孵育结束后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的离心管中，加入少量的中和缓冲液将pH调至中性，最后进行Western检测。

4.2 SDS-PAGE上样缓冲液洗脱

每20 μL 原始磁珠体积加入60 μL的1× SDS Loading Buffer，轻摇摇晃混匀后95-100℃高温处理5-10 min。将离心管置于磁力架上分离10 s，取上清进行SDS-PAGE电泳或进行Western检测。

注意事项

1. 本产品保存在2-8℃，不可冻结保存；

2. 本产品出现轻微团聚属正常现象，可正常使用；

3. 本产品不要使用含有DTT等还原剂的细胞裂解液样品，DTT可能会导致抗体配体的脱落；

4. 本产品能耐受≤2 M尿素，高浓度的尿素会导致抗体配体脱落；

5. 在清洗和洗脱时避免吸取到磁珠，清洗时吸取到磁珠会影响最终的载量，洗脱时吸取到磁珠会影响目的蛋白的质量和电泳效果，第一次洗脱后可以将洗脱液置于新的离心管中，再次置于磁力架上进行吸附。

常见问题及解答

Q：聚合物磁珠和琼脂糖磁珠有何区别？

A：

琼脂糖磁珠是带孔微球，粒径在30-100 μm，交联时会有一部分配体会进入球孔内部，所以偶联载量相对较高，适用于蛋白的快速纯化；而聚合物磁珠通常粒径为1-3 μm以下，配体主要分布在微球表面，这种类型的磁珠能够快速结合蛋白，空间位阻影响小，适用于蛋白互作实验，但其载量不高；
推荐使用琼脂糖磁珠进行蛋白纯化实验，使用聚合物磁珠进行蛋白互作实验如IP、Co-IP和Pull-down实验等。
Q：为何结合不到目的蛋白？

A：

目的蛋白无表达或表达量过低：建议纯化前用 Western blot (WB) 检测原始表达量，WB 无信号则难以捕获；
样本含高浓度还原剂（如 DTT、β-ME）：破坏抗体二硫键导致配体脱落，需选用无还原剂的温和裂解液；
Flag 标签被空间位阻遮挡：融合蛋白折叠导致标签隐藏，可尝试将标签移至蛋白 N 端 / C 端或增加柔性连接肽（如 (GGS)ₙ）；
孵育条件不足：温度 / 时间未优化（如室温孵育 < 30 min、4℃孵育 < 1 h），或未旋转混匀导致结合不充分；
磁珠用量不足：按样本中目的蛋白量调整磁珠体积（通常 20 μL 磁珠对应 1–5 mg 总蛋白）；
洗涤过于剧烈：剧烈涡旋导致结合蛋白脱落，建议轻柔颠倒混匀而非涡旋。
实例

1. HA tag IP实验：样品为胞内表达蛋白，含有His和HA标签；

2. 取0.5 mL 悬浮细胞（≈1.5×10⁶个）常温下1×PBS（pH 7.4）清洗三次后快速进行裂解、离心；

3. 加入20 μL 已经清洗过的磁珠于离心后的上清中摇晃孵育30 min；

4. 将含有磁珠的样品管转移到磁力架上，分离磁珠和液体，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5. 用洗杂缓冲液清洗5次后加入1× SDS Loading Buffer 99℃高温处理10 min后进行WB；

6. 检测抗体为Anti-His-HRP mAb，阴性对照（-）为未偶联 Anti-HA 抗体的空白高聚物磁性微球与样本孵育，结果请见图2。

图2：通过Anti-HA Magnetic Beads进行IP后的WB图

图2表明Anti-HA Magnetic Beads能够很好的捕获样品中的HA标签融合蛋白，同时没有非特异性的蛋白结合。