产品介绍

产品介绍Caspase 8 活性检测试剂盒(Caspase 8 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 8酶活性或纯化的caspase 8酶活性的试剂盒。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 8通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活。Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中caspase 8被激活，形成一个由p18和p10组成的二聚体，进一步激活下游的caspase 4，caspase 6，caspase 9和caspase 10。本Caspase 8活性检测试剂盒是基于caspase 8可以催化底物Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Aspp-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有强吸收。试剂盒中提供了caspase 8催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 8酶活性的标准品。C1375235Component20 T50 T100TStorage conditionsC1375235ALysis Buffer8 mL20 mL40 mL-20℃.C1375235BAssay Buffer8 mL20 mL40 mL-20℃.C1375235CAc-IETD-pNA(2 mM)200 μL500 μL1000 μL-20℃.Store in the dark.C1375235DpNA(10 mM)120 μL300 μL600 μL-20℃.Store in the dark.C1375235EDTT(100×)160 μL400 μL800 μL-20℃.Store in the dark.C1375235FProtease Inhibitor Cocktail（100×）80 μL200 μL400 μL-20℃.Store in the dark.
使用方法1. 试剂准备(1) Lysis Buffer：使用前，立即加入DTT和Protease Inhibitor Cocktail，每1 mL Lysis Buffer分别加入10 μL DTT (100×)和10 μL Protease Inhibitor Cocktail (100×)，根据实验样本数量现配现用，冰上备用。(2) Assay Buffer：使用前立即加入DTT，每1 mL Assay Buffer分别加入10 μL DTT (100×)，根据实验样本数量现配现用，至于冰上备用。(3) Ac-IETD-pNA (2 mM)：使用前置于冰上备用。根据实验样本数量适量分装，避免反复冻融。(4) pNA (10 mM)：使用前置于冰上备用。根据实验样本数量适量分装，避免反复冻融。2. pNA标准曲线的设置标准品稀释液的配制：按照每0.9 mL Assay Buffer加入0.1 mL Lysis Buffer的比例配制适量的标准品稀释液。取6支EP管，第一支EP管中加入294 μL标准品稀释液，其他每管中加入150 μL标准品稀释液，从pNA (10 mM)标准品中吸取6 μL到第一支EP管中，混匀配成200 μM pNA标准溶液，吸取150 μL到第2支EP管，混匀后吸取150 μL到第3支EP管，按此步骤往后依次稀释，最后一支EP管为150 μL标准品稀释液。此时，标准品的浓度依次为200、100、50、2
5、12.
5、0 μM。立即测定A405，并制作标准曲线。3. 样本制备（1）对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清。PBS洗涤细胞一次后按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200微升），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。（2）对于贴壁细胞：用胰酶消化贴壁细胞，并收集至细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清。PBS洗涤细胞一次后按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200微升），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。（3）对于组织样本：按照每3-10 mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5 mL离心管中，冰浴再裂解5分钟。根据样本类型，按照上述步骤裂解细胞后，4℃ 16,000-20,000 g离心10-15分钟。把上清转移到预冷的离心管中，避免吸到沉淀或靠近沉淀的粘稠层。若样本粘稠度太大，可在冰浴上进行短促的脉冲超声，4℃ 16,000-20,000g离心10-15分钟，取上清用于检测。立即测定caspase 8的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3 mg/mL。4. 活性检测按照下表设置反应体系。在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡，最后再加入10 μL Ac-IETD-pNA(2 mM)。Blank ControlSampleAssay Buffer40 μL40 μLSamples-50 μLLysis Buffer50 μL-Ac-IETD-pNA(2 mM)10 μL10 μLTotal volume100 μL100 μL37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 8催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。参考Chemicon公司的caspase 8酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-IETD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1 nmol Ac-IETD-pNA产生1 nmol pNA的caspase 8的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 8。
注意事项1. Ac-IETD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。2. 测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒。建议样品用水稀释1倍后再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。3. pNA(中文名为4-硝基苯胺)对人体有毒，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。