产品介绍

Caspase 1是caspase家族中唯一可以剪切IL-1b前体蛋白或IL-18前体产生相应成熟的细胞因子的caspase。Caspase 1可以剪切45kD的caspase 1前体蛋白，产生20kD和10kD的片段，这两个片段可以形成异源二聚体(heterodimer)，并进一步由两个异源二聚体形成四聚体。Caspase 1可以通过剪切其凋亡Bcl-XL来调节细胞凋亡，并通过其对一些细胞因子前体的剪切来调控相关免疫反应。本caspase 1活性检测试剂盒是基于caspase 1可以催化底物Ac-YVAD-pNA(acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定405 nm处的吸光度来检测caspase 1的活性。C1375245组分20 T50 T100T储存条件C1375245A裂解液8 mL20 mL40 mL-20℃.C1375245B检测液8 mL20 mL40 mL-20℃.C1375245CAc-YVAD-pNA(2 mM)200 μL500 μL1000 μL-20℃.避光保存.C1375245DpNA(10 mM)120 μL300 μL600 μL-20℃. 避光保存 .C1375245EDTT(100×)160 μL400 μL800 μL-20℃. 避光保存 .C1375245F蛋白酶抑制剂混合物 （100×）80 μL200 μL400 μL-20℃. 避光保存 .
使用方法1. 试剂准备(1) 裂解液：使用前，立即加入DTT和蛋白酶抑制剂混合物，每1 mL裂解液分别加入10 μL DTT (100×)和10 μL 蛋白酶抑制剂混合物 (100×)，根据实验样本数量现配现用，冰上备用。(2) 检测液：使用前立即加入DTT，每1 mL 检测液分别加入10 μL DTT (100×)，根据实验样本数量现配现用，至于冰上备用。(3) Ac-YVAD-pNA(2 mM)：使用前置于冰上备用。根据实验样本数量适量分装，避免反复冻融。(4) pNA (10 mM)：使用前置于冰上备用。根据实验样本数量适量分装，避免反复冻融。2. pNA标准曲线的设置标准品稀释液的配制：按照每0.9 mL 检测液加入0.1 mL 裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。取6支EP管，第一支EP管中加入294 μL标准品稀释液，其他每管中加入150 μL标准品稀释液，从pNA (10 mM)标准品中吸取6 μL到第一支EP管中，混匀配成200 μM pNA标准溶液，吸取150 μL到第2支EP管，混匀后吸取150 μL到第3支EP管，按此步骤往后依次稀释，最后一支EP管为150 μL标准品稀释液。此时，标准品的浓度依次为200、100、50、2
5、12.
5、0 μM。立即测定A405，并制作标准曲线。3. 样本制备（1）对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清。PBS洗涤细胞一次后按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200微升），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。（2）对于贴壁细胞：用胰酶消化贴壁细胞，并收集至细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清。PBS洗涤细胞一次后按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200微升），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。（3）对于组织样本：按照每3-10 mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5 mL离心管中，冰浴再裂解5分钟。根据样本类型，按照上述步骤裂解细胞后，4℃ 16,000-20,000 g离心10-15分钟。把上清转移到预冷的离心管中，避免吸到沉淀或靠近沉淀的粘稠层。若样本粘稠度太大，可在冰浴上进行短促的脉冲超声，4℃ 16,000-20,000g离心10-15分钟，取上清用于检测。立即测定Caspase 1的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3 mg/mL。4. 活性检测按照下表设置反应体系。在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡，最后再加入10 μL Ac-YVAD-pNA(2 mM)。空白对照样本检测液40 μL40 μL样本-50 μL裂解液50 μL-Ac-YVAD-pNA(2 mM)10 μL10 μL总体积100 μL100 μL37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 1催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。参考Chemicon公司的caspase 1酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-YVAD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-YVAD-pNA产生1nmol pNA的caspase 1的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 1。
注意事项1. Ac-YVAD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。2. 测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒。建议样品用水稀释1倍后再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。3. pNA (中文名为4-硝基苯胺)对人体有毒，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。