Hotstart HiTaq DNA 聚合酶

产品介绍

Hotstart HiTaq DNA Polymerase是一种化学基团修饰的耐热性Taq DNA聚合酶，高温加热前，化学修饰基团与Taq酶结合，抑制聚 合酶的活性，避免了引物延伸的非特异性扩增或引物二聚体的产生，增强了DNA扩增的特异性、灵敏度和稳定性，可广泛适用于 常规PCR、多重PCR及巢式PCR等。经过95℃热激10 min后，该酶即可恢复活性。此外Hotstart HiTaq DNA Polymerase没有检测到 3'→5'校对外切酶活性，但具有5'→3'外切酶活性，可用于荧光定量PCR的检测。Hotstart HiTaq DNA Polymerase在常温下没有活性，便于PCR实验的常温操作。组分表 FP1509104 组分250U1KU5KU存储温度FP1509104A Hotstart HiTaq DNA Polymerase (5U/μL)50 μL200 μL1.0 mL-20℃FP1509104B 5×HS HiTaq Buffer (Mg²⁺ Plus)1.0 mL4×1.0 mL20 mL-20℃FP1509104CSolution I (10×)500 μL2×1.0 mL10 mL-20℃适用范围适用于热启动 PCR 及 qPCR。
注意事项引物设计1. 引物 3'端最后一个碱基最好为 G 或者 C； 2. 引物 3'端最后 8 个碱基应避免出现连续错配； 3. 引物 3'端应避免出现发夹结构； 4. 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1℃为佳，Tm 值调整 至 55 ~ 65℃为佳（引物 Tm 值推荐使用 Primer Premier 5 进行计算）； 5. 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物 Tm 值计算；6. 引物的 GC 含量控制在 40% ~ 60%之间； 7. 引物 A、G、C、T 整体分布要尽量均匀，避免使用 GC 或者 AT 含量高的区域； 8. 引物内部或者两条引物之间避免有 5 个碱基以上的互补序列， 两条引物的 3'端避免有 3 个碱基以上的互补序列； 9. 引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性，以避 免非特异性扩增产生。
使用方法 溶解并混匀PCR反应所需的各种溶液，并放置于冰浴上或冰盒内。 建议反应PCR液体分装使用，避免反复冻融。参考下表设置PCR 反应：1. PCR 反应体系的设置：ComponentAdded VolumeFinal Concentration5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺ Plus)4 μL1×Solution I（10×）2 μL1×dNTP（25mM each）0.16 μL0.2 mMHotstart HiTaq DNA Polymerase（5U/μL）0.2 μL—Forward Primer（10μM）0.4 μL0.2 μMReverse Primer（10μM）0.4 μL0.2 μM模板 *4 μL(※)—ddH₂OTo 20 μL—终体积20 μL※ 模板DNA 用量：为了保证反应的灵敏性，20 μL体系使用10⁴拷贝的靶序列作为模板，可参考下表计算需加入PCR体系的模板量。 1μg 各种来源的 DNA 对应的摩尔数 1 μg DNAMol1 kb 线性双链 DNA9.18×10¹¹3 kb 质粒 DNA2.9×10¹⁰Lambda (λ) DNA1.9×10¹⁰E.coli 基因组 DNA2.0×10⁸人类基因组 DNA3.0×10⁵例如：纯化的人类基因组 DNA 浓度为 1μg/μL，某基因在人类基因组中拷贝数为 10，其单位体积拷贝数为：3.0×10⁵ mol/μg×1μg/μL×10 copy/mol=3.0×10⁶ copy/μL1×10⁴copy/(3.0×10⁶ copy/μL)=1/300μL即：1/300μL 浓度为 1μg/μL 的人类基因组 DNA 中含 10⁴ 拷贝该基因，稀释 300 倍后加 1μL 至 25μL PCR 体系。为保证反应的特异性，DNA 终浓度应小于 10 ng/μL，过多的 DNA 可能会出现涂抹带甚至无特异性条带。2. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微 Vortex 混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。3. 各设置好的 PCR 反应管置于 PCR 仪上，开始 PCR 反应。反应程序1. 常规定性 PCR（以扩增 1 kb 目的片段为例） 2. 荧光定量 PCR a. PCR 反应的设置需根据模板、引物、PCR 产物的长度和 GC 含量等条件的不同设定不同的 PCR 反应条件包括温度、时间和循环数等。b. STEP4 (延伸) 的时间设置需根据 PCR 产物的长度进行设置，通常每 kb 产物的延伸时间为 1 min。例如 PCR 产物的长度为 1 kb，则延伸时间可以设置为 1min，PCR 产物的长度为 2 kb，则延伸时间可以设置为 2 min，以此类推。c. 对于初次进行的 PCR，为尽量确保可以扩增出预期的 PCR 产物，可以把循环数设置为 35。对于需进行半定量或定量的 PCR 反应循环数一定要进行适当优化，使 PCR 反应达到平台期。