钙黄绿素-AM溶液

产品介绍

Calcein AM，中文名钙黄绿素乙酰氧基甲酯，是一种可渗透进入细胞、常用于测定真核细胞活力或线粒体通透性转换孔 (Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的绿色荧光探针。Calcein AM近年来被广泛应用到细胞活性分析实验中。

Calcein AM 是在Calcein (钙黄绿素)的基础上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基团，加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。Calcein AM本身并无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein)，从而被滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光（Ex/Em = 494/517 nm）。与其它同类探针相比，由于Calcein AM的细胞毒性非常低，几乎不会影响细胞功能如细胞增殖或淋巴细胞的趋化等，而且对pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前染活细胞的最理想荧光探针之一。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein AM仅用于对活细胞的活力测试和短期标记，而核酸红色荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 由于不能穿透活细胞的细胞膜而只能染色细胞膜完整性被破坏的死细胞，所以Calcein AM常常与碘化丙啶(PI)联合使用，对活细胞和死细胞同时进行双重荧光染色。

使用方法

1. 工作液的配制

用合适的缓冲液，如无血清培养液、HBSS或PBS按照1:1000稀释本产品，即得到染色工作液。

注：Calcein AM的最终浓度建议根据细胞类型和实验实际情况进行适当调整。

2. 染色

a. 对于贴壁细胞：

(a) 将细胞接种于培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。轻轻吸除孔板中的培养液，PBS洗涤约10秒，吸除PBS。

(b) 加入适当体积的Calcein AM染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

注：对于在六孔板中培养、汇合度超过80%的贴壁细胞，建议按1 mL/well 加入染色工作液，也可根据具体的实验体系进行优化。

(c) 37ºC孵育细胞10-45min，不同的细胞最佳孵育时间不同。可以考虑以10min作为初始孵育时间，根据具体的实验情况进行适当优化得到更加理想的检测效果。

(d) 吸除染色液，用PBS清洗2-3次，然后加入无血清细胞培养液后即可在荧光显微镜下观察，在 ​Ex/Em = 494/517 nm 下观察绿色荧光，也可以在染色结束后进行流式细胞仪分析检测或使用荧光酶标仪检测细胞的荧光。

b. 对于悬浮细胞：

(a) 细胞按实验设计进行一定处理后，计数。取适当细胞，500×g室温离心5分钟，轻轻吸除培养基后加适量PBS重悬，500×g室温离心5分钟，去除PBS。

(b) 加适量Calcein AM染色工作液，使细胞密度约为 10⁶ 个/mL 。

(c) 37ºC孵育细胞10-45min，不同的细胞最佳孵育时间不同。可以考虑以10min作为初始孵育时间，根据具体的实验情况进行适当优化得到更加理想的检测效果。

(d) 直接滴加于载玻片上，加盖盖玻片，置于显微镜下观察，在 ​Ex/Em = 494/517 nm 下观察绿色荧光，也可以在染色结束后进行流式细胞仪分析检测或使用荧光酶标仪检测细胞的荧光。

注：若背景影响严重，可以离心去除染液后使用PBS清洗1-2遍，再置于显微镜下观察。

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

2. 荧光染料存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。