细菌RNA提取试剂盒（DNase I）

产品介绍

产品内容 组分 50T DNase I 1000U 10×Reaction Buffer 1000μl Buffer RL 35ml Buffer RW1 40ml Buffer RW2（concentrate ） 11ml RNase- Free Water 10ml Spin Columns FL with Collection Tubes 50 with Collection Tubes with Collection Tubes 50 RNase-Free Centrifuge Tubes（1.5 ml） 100产品简介本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从细菌或培养的动物细胞中快速提取总RNA。30-40分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他污染，适用于RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、体外翻译等实验。自备试剂：Lysozyme、β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）。实验前准备及重要注意事项1. 预防RNase污染，应注意以下几方面：1） 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。2） 配制溶液应使用无RNase的水。3） 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。2. Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇至终浓度为1%，如1 ml Buffer RL加10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL 4℃可保存1个月，如出现沉淀，请加热溶解后使用。3. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。4. 如未特殊说明，所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。操作步骤1．4℃ 12,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟收集菌体（菌体量最大不超过1×109）， 小心去除所有上清。注意：上清如果有残留，会影响后续的消化过程。2. 用含有Lysozyme的100 μl TE缓冲液彻底重悬菌体，室温孵育。具体配方和孵育时间如下： / TE缓冲液中Lysozyme的终浓度 孵育时间 G-细菌 400μg/ml 3-5分钟 G+细菌 3mg/ml 5-10分钟3. 加入350 μl Buffer RL（使用前请检查是否加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀（此步骤可能出现不溶性沉淀），将溶液与沉淀全部加入到已装入收集管的过滤柱（Spin Columns FL）中，12,000 rpm离心2分钟。4. 向上步得到的滤液中加入250 μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱（Spin Columns RM）中，12,000 rpm 离心1分钟，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80 μl的反应液。7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1分钟,弃废液。10. 重复步骤9。11. 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。12.将吸附柱装入新的RNase-Free的收集管中，向吸附膜的中间加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000    rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。注意：1） RNase-Free Water体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。2） 如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤12。如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。