Protein G 抗体纯化试剂盒

产品介绍

链状球菌蛋白G，简称Protein G,是一种来自链状球菌的细胞壁蛋白。分子量约为25kDa。由白蛋白结合域 (ABD1, ABD2, ABD3)和免疫球蛋白结合域构成。与Protein A相似，Protein G可与IgG的Fc区特异性结合,但Protein G能够特异性结合的抗体种类更加广泛，对于非常见物种IgG的结合能力也比较好，血清蛋白结合水平更低，纯度也更高。Protein A 和Protein G结合性能不太一样，相比Protein A，Protein G对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力，它还可以结合不能与Protein A很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1。蛋白G作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。 本试剂盒可以纯化来自腹水，血清，细胞培养物上清等样本形式的抗体。试剂盒中的Protein G纯化填料可以重复使用10次以上，偶联在琼脂糖珠上的Protein G是纯化人、大鼠、小鼠，山羊，绵羊IgG抗体（包含单克隆或多克隆）的理想选择，高特异性，高稳定性，高亲和力，低配基脱落。
使用方法 使用前，需用去离子水将各组分缓冲液稀释至 1× 浓度。具体操作可根据不同纯化工具的要求调整。一．样品制备在纯化之前，必须通过离心或 0.45 μm 过滤器过滤来澄清杂交瘤组织上清、血清或腹水样品，以免堵塞纯化柱，降低纯化柱寿命。注：本试剂盒中Protein G填料的动态结合载量≥30 mg hIgG/mL，实际操作时建议IgG上样量不超过该动态载量的80%（即单根色谱柱单次上样IgG总量应≤24 mg），以避免填料过载并保证纯化效果。由于杂交瘤细胞克隆的表达特性不同，其组织培养上清中的抗体浓度可能存在较大波动，因此每次纯化的实际得量通常介于2-10 mg之间，具体数值需根据实验条件（如上清液抗体浓度、样品体积等）实际测定。二．样品纯化2.1 装柱1. 将纯化柱垂直固定，确认下方垫片已水平固定。2. 取 2mL Protein G resin加入柱管，待填料在柱底部堆积后，小心放入上层垫片并压实填料。3. 取下下方堵头，使柱管内液体自然滴落，最终 Protein G 纯化柱的有效体积为 1mL。注：Protein G 树脂中含 50% 保护液，填装前需充分混匀，防止影响纯化效率。放置垫片时，需尽量保持柱内液面平整，避免填料与垫片间产生气泡。气泡会降低分离效率，并增加维持稳定流速所需的压力2.2 平衡取 1× 结合缓冲液（Binding buffer）倒满纯化柱（约 15 个柱体积），用于平衡柱体，使液体自然滴落。2.2 上样取下纯化柱上盖，将澄清后的样品加入 Protein G 纯化柱中，使液体自然滴落。注：若样品中抗体含量较低或样品体积较大，可通过增加上样次数、延长上样时间，提升抗体与填料的结合效率。2.3 洗涤取 1× 结合缓冲液（Binding buffer）倒满纯化柱（约 15 个柱体积），清洗柱内未结合的杂质，使液体自然滴落。2.4 洗脱1. 准备数个 1.5mL 离心管，向每个离心管中预先加入 10μL 中和缓冲液（Neutralization Buffer）。2. 向每个纯化柱中加入 3mL 1× 洗脱缓冲液（Elution buffer，约 3 个柱体积），通过重力作用收集洗脱液。每管收集 8 滴洗脱液（约 0.5mL），依次操作直至洗脱完成。2.5 透析:1. 从每管洗脱液中取 2.5μL，与 10μL 考马斯亮蓝染色液（Coomassie Brilliant Blue Staining Solution）混合，观察抗体洗脱的梯度变化。2. 收集抗体浓度较高的洗脱管，将其置于适宜的缓冲液中进行透析置换，最终获得高纯度的纯化 IgG。三．纯化柱储存 3.1 抗体洗脱完成后，继续向柱内加入 2mL 1× 洗脱缓冲液（Elution buffer）洗涤，避免柱内残留抗体。3.2 取 1× 结合缓冲液（Binding buffer）倒满纯化柱（约 15 个柱体积），平衡柱体，使液体自然滴落。3.3 取 20% 乙醇倒满纯化柱（约 15 个柱体积），进行防腐处理，使液体自然滴落。3.4 向柱内加入 5mL 20% 乙醇，盖上上盖并堵紧下方堵头，于 2-8℃条件下储存，下次纯化时可直接取出使用。四．柱再生 （可选）当纯化柱的性能出现可观测的下降时，即应执行再生程序，具体操作如下：4.1 向柱内加入 10mL 再生缓冲液（Regeneration Buffer），进行洗涤。4.2 加入 30mL 超纯水（ddH₂O）清洗柱体，确保将再生缓冲液彻底冲洗干净。4.3 加入 20mL 1× 结合缓冲液（Binding buffer）洗涤，平衡填料。4.4 加入 15mL 20% 乙醇洗涤后，再向柱内加入 5mL 20% 乙醇，盖上上盖并堵紧下方堵头，于 2-8℃条件下储存。