V5标签免疫(共)沉淀试剂盒(纳米抗体磁珠法)

产品介绍

V1506149Components20T100TStorage temperatureQuantity Per TestV1506149AAnti-V5 纳米抗体磁珠0.4 mL2 mL4°C20 μL per 250 μg sampleV1506149B1x裂解液 20 mL100 mL4°C150 μL per 250 μg sampleV1506149CV5 多肽0.2 mL1 mL-20°C10 μL per 100 μL wash BufferV1506149D酸性洗脱液2 mL10 mL4°C100 μL per 250 μg sampleV1506149E10x 洗液40 mL200 mL4°C500 μL per 250 μg sampleV1506149F中和液0.2 mL1 mL4°C10 μL per 100 μL Acid Elution BufferV1506149G蛋白酶抑制剂(100x)0.2 mL1 mL-20°C1.5 μL per 150 μL Lysis BufferV1506149H2xSDS-PAGE 上样缓冲液0.4 mL2 mL-20°C20 μL per 250 μg sample
注意事项1. Anti-V5 Magnetic Beads用量可按实验实际进行取用。2. 在进行蛋白互作操作之前，请务必认真阅读此说明书。3. 除非另有说明，所有操作建议于4℃下进行, 以尽量减少蛋白降解的可能性。若细胞裂解不够完全可在使用裂解液之后使用超声裂解细胞。4. 填料应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。5. 经煮沸后的填料失去结合能力，经煮沸的填料不应再次使用。6. 本产品仅限于专业人员的科学研究使用。7. 请注意安全事项，遵守实验室试剂操作规范操作。8. 本试剂盒内包含的裂解液已包含蛋白酶抑制剂，如果有特殊需求，可考虑选择其它适当的抑制剂混合物。9. Anti-V5 Magnetic Beads使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。10. 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。
使用方法1. 试剂准备下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备：(1). 自备试剂：a) 一抗：V5 tag 抗体b) 二抗：Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)c) 其它试剂：TBST、 电泳液、转膜液、 还原型 SDS-PAGE 凝胶(2). 所需仪器：电泳仪、转膜仪、成像仪以上试剂若有需求，可以订购阿拉丁的 V5 tag Mouse mAb ( Ab133823 )、 Recombinant V5 tag Antibody ( Ab086830 )、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) ( Ab176443)、 Recombinant Protein A/G, HRP conjugate(rp303272)、Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (Ab179001)2. 溶液配置可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。所有缓冲液在使用前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤，缓冲液建议4°C保存，若试剂浑浊，请立即丢弃。(除非另有说明，所有操作建议于4℃下进行)a) 按照每50-100万细胞使用100-200μl含抑制剂裂解液，配制适量的含抑制剂裂解液。将Lysis Buffer与Protease Inhibitor Cocktail (100x)按照100:1的 比例混合，例如在1ml的Lysis Buffer中加入10μl Protease Inhibitor Cocktail (100x)，即得1ml含抑制剂裂解液(Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail)。配制好的含抑制剂裂解液宜放置在冰浴或4ºC。 注：含抑制剂裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存并留作后续使用。b) V5多肽洗脱液配置(1.5 mg/mL)：取一定量V5多肽储存液用wash buffer 溶液进一步稀释His多肽溶液至150 μg/mL。即 10 μL的多肽，加入到 90 μL 的wash buffer中，混匀后终浓度为150 μg/mL。也可根据实验需求进行调整。c) 1x wash buffer 配置：按照 9:1 的比例用去离子水将 10 x wash buffer 稀释待用。例如：1mL 10xwash buffer 加 入 9mL 去离子水，混匀后即为 1× wash buffer。c) 磁珠漂洗。轻轻重悬Anti-V5 Magnetic Beads，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，按照通常每 250 ug 中加入20μl混合均匀的磁珠悬浊液(以下免疫沉淀步骤中都以每样加入20μl凝胶悬浊液为例)至一洁净离心管中， 加入1x wash buffer 至最终体积为约0.5mL。重复上述步骤两次。 注：使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液会比较方便。3. 待测样品准备a) 对于血清样本的准备:若目标蛋白丰度较高，建议用裂解液稀释血清样本至目标蛋白终浓度为 50~150 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)b) 对于贴壁细胞的裂解和准备：吸除培养液，用PBS洗涤2次，然后吸净残留的液体。按照每50-100万细胞(相当于6孔板的一个孔)加入100-200μl的含抑制剂裂解液，适当吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2-10min。充分裂解后，用细胞刮刀刮落细胞，收集至 1.5 mL 离心管内10,000-14,000×g在4ºC离心3-5分钟，取上清，进行蛋白浓度测定后即可进行后续的免疫沉淀或免疫共沉淀等。注：裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。c) 悬浮细胞样品裂解250-1000×g室温离心5min收集细胞；用PBS洗涤2次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照每50-100万细胞加入100-200μl的比例加入含抑制剂裂解液。混匀后置于冰上孵育5~20 min(期间混匀几次)，轻弹管底或适当吹打，以充分裂解细胞向细胞团块中加入预冷 Lysis Buffer（含抑制剂按1%加），每50-100万细胞加入150-250 μL的比例加入含抑制剂裂解液；充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，建议分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。充分裂解后，10,000-14,000×g在4ºC离心3-5分钟，取上清，进行蛋白浓度测定后即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。d) 对于细菌或酵母样品的裂解和准备：对于1ml菌液或酵母液，离心去上清，用PBS洗涤2次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底以把细菌或酵母尽量分散开。加入100-200μl含抑制剂裂解液，轻轻vortex或者弹击管底以混匀，冰上裂解2-10min。如果希望获得更好的裂解效果，细菌和酵母可以分别使用溶菌酶(lysozyme)和破壁酶(lyticase)消化，然后再使用含抑制剂裂解液进行裂解。充分裂解后，10,000-14,000×g在4ºC离心3-5分钟，取上清，进行蛋白浓度测定后即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注1：裂解后很可能会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。注2：如果是可溶蛋白，直接取上清进行使用，如果是包涵体，则取沉淀，对包涵 体进行洗涤以及变性复性。e) 对于组织样品的裂解和准备：把组织剪切成细小的碎片，按照每20毫克组织加入约100-200微升裂解液的比例加入裂解液，然后用玻璃匀浆器或其它匀浆设备进行匀浆。充分匀浆可以确保组织被完全裂解。裂解后4ºC 12000g离心5分钟，取上清，进行蛋白浓度测定后即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注1：裂解后很可能会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。注2：对于所有样品如果样本中目标蛋白丰度较低，或结合物间的结合较弱，可以增加初始样本量，同时等比例增加裂解缓冲液和酶抑制剂的用量，但总孵育体积最大不超过离心管体积的2/3，体积过大可以更换大规格离心管。4. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)a) 加入磁珠与孵育。按照每250 μg 蛋白样品加入20 μL磁珠悬浊液的加入新的微量离心管中，置于磁力架上静置1分钟，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。b) 分离。孵育结束后，置于磁力架上静置1分钟 ，将上清转移至新的离心管中，留样备检。c) 洗涤。加入0.5 mL的wash buffer，用移液器轻轻吹打重悬凝胶。置于磁力架上静置1分钟 ，去除上清。重复使用 wash buffer 洗涤三次。得到蛋白-beads复合物。注：也可以通过检测洗涤得到的液体的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。5. 蛋白洗脱根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。a) 非变性洗脱法每20 μL原始磁珠体积，加入100 μL V5多肽洗脱液，置于垂直旋转混合仪 4℃孵育 1-2 h，置于磁力架上静置1分钟 ，吸取上清液，收集洗脱组分，即为V5标签蛋白及其复合物，为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱，V5标签及其复合物置于 4℃待用，-20℃或-80℃长期保存。如洗脱效果不佳，则可提高V5多肽浓度或多次洗脱。b) SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱每20ul原始磁珠体积加入30ul 的PBS（自备）重悬磁珠，再加入30uL的2×SDS Loading Buffer，轻摇摇晃混匀后95-100℃高温处理5-10分钟。1000 rpm 离心1min，取上清进行SDS-PAGE 电泳或进行Western 检测。注 1: Anti-V5 纳米抗体磁珠没有抗体轻重链污染问题，建议首选变性洗脱法，洗脱效率更高。注 2：Western 检测的上样量建议控制在 20uL 以内，剩余的样本可冻存于-20℃保存。 c) 酸性洗脱每20 μL原始磁珠体积，加入100 μL Acid Elution Buffer (酸性洗脱液)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。1000 rpm 离心1 分钟，将上清转移到新的离心管中。如需中和中性缓冲液，可加入10 μL Neutralization Buffer (中和液)，调整pH至中性。注: 由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱 液的pH在2.5-3.0之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，具体需要自行优化相关实验条件。 也可以考虑采用效率可能更高的His多肽竞争洗脱法或效率预期最高的SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法，后者的缺点是在 变性条件下进行洗脱，可能会对后续的对于蛋白活性有要求的实验产生影响。