Alkyne蛋白标记试剂盒

产品介绍

Alkyne蛋白标记试剂盒 可以快速高效的在含有伯胺基团的目标蛋白中引入炔基基团，随后进行点击化学标记。本试剂盒标记的蛋白、抗体等能在一价铜离子催化下快速、高效地偶联叠氮化物标记的 (Azide-tagged) 的生物分子，以进行标记、追踪、纯化或分离，可以用于蛋白-蛋白、蛋白-生物分子、DNA-蛋白的相互作用研究等，是医学和生命科学研究中的重要工具。 

注意事项

1. 纯化后的蛋白质应置于不含伯胺（例如，叠氮化物、铵离子、Tris、甘氨酸、乙醇胺、三乙胺、谷胱甘肽）或咪唑的缓冲液中。所有这些物质都会显著抑制蛋白标记。

2. 不纯的蛋白质或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的蛋白质将无法被高效标记。

3. 交联剂对湿气敏感。打开前应将试剂管平衡至室温，以防止试剂管凝结水分。使用试剂盒中提供的无水溶剂配制储备液后，可将其分装并在-20°C下储存，在此条件下可稳定保存两个月。在-80°C下储存可保存更长时间。

4. 离心脱盐柱的上样体积必须在2-4mL之间，以确保最佳性能。超出此范围的上样体积可能导致蛋白质回收率降低或未偶联试剂去除不彻底。

5. 请勿重复使用离心脱盐柱。

使用说明

1. 制备蛋白质样品

1.1 将目标蛋白溶解于不含胺、铵离子或叠氮化物的缓冲液（pH 7-9）中，因为这些物质会干扰标记反应。如有必要，在标记前将目标蛋白通过透析或缓冲液置换的方式更换到合适的缓冲液中，例如PBS（1X）。

1.2 在PBS溶液中制备浓度为1-10 mg/mL的蛋白质样品。最终体积应≤ 4mL。

2. 计算Alkyne-NHS体积

Alkyne-NHS的最佳用量取决于所需的标记程度。通常，较高的蛋白质浓度或表面具有更多可接触伯胺（例如赖氨酸残基）的蛋白质，需要较少的Alkyne-NHS即可达到所需的标记密度。关于Alkyne:蛋白质比例的建议，请参见表1。

表1. Alkyne-NHS与目标蛋白的推荐摩尔比

2.1 计算摩尔比为X：1所需的Alkyne-NHS试剂毫摩尔数：

mmol Alkyne -NHS = (mg/mL protein × mL protein) / MW protein (mg/mmol) × molar ratio

2.2 计算需添加到反应体系中的10mg/mL Alkyne-NHS体积：

μL Alkyne-NHS = (mmol Alkyne-NHS × 225.2 / 10) × 1000

2.3 示例：对于2.5mL 的2 mg/mL 链霉亲和素蛋白（分子量 = 60,000 g/mol），摩尔比为20:1时，需向制备好的样品中加入37.5 μL的10mg/mL Alkyne-NHS试剂。

mmol Alkyne -NHS = (2mg/mL protein × 2.5mL protein) / 60000 (mg/mmol) × 20 = 1.67 × 10⁻³ mmol

μL Alkyne-NHS = ( 1.67 × 10⁻³ mmol Alkyne-NHS × 225.2 / 10) × 1000 = 37.5 μL

3. 蛋白质标记步骤

3.1 将Alkyne-NHS酯平衡至室温。

3.2 使用前，配制交联剂。向Alkyne-NHS的试剂管中加入1 mL DMSO，得到10mg/mL的储备液。涡旋或用移液器反复吹吸直至溶液均一。如不立即使用，可分装后-20ºC保存。

3.3 量取计算体积的10 mg/mL Alkyne-NHS试剂加入制备好的蛋白溶液中。

3.4 将反应混合物在室温下孵育1小时，或在冰上孵育2小时。

4. 脱盐柱预平衡

4.1 将一个空的离心柱放入一个 50mL 收集管中。

4.2 通过反复倒置试剂瓶重悬纯化树脂。然后取14 mL悬液加入柱中，让树脂沉降。让柱缓冲液依靠重力从柱中排出。初始时，可能需要施加一些压力使最初的几滴缓冲液流出。以 1,000 × g 离心柱子 2 分钟，弃去储存缓冲液，将柱子放回同一个收集管中。

注意：纯化树脂以 20% 乙醇的悬液形式提供，树脂与乙醇的体积比为 3:1 (v/v)。

4.3 通过在树脂床顶部加入 10 mL PBS，以 1,000 × g 离心 2 分钟来平衡柱子，弃去流出液，此步骤总共重复 3 次。此时柱子平衡完成。

注意：使用定角转子时，在柱子背对转子中心的一侧做标记。在后续所有离心步骤中，将柱子放入离心机时，标记面应背对转子中心。

5. 纯化Alkyne标记的蛋白质

5.1 将平衡好的离心柱转移到一个新的收集管中。

5.2 小心地将整个反应混合物（2-4mL）加到柱子的中心位置。

5.3 脱盐柱1000xg离心2分钟，收集管中的流出即为所需收集的Alkyne标记的蛋白。