mcKLH偶联试剂盒（EDC法）

产品介绍

钥孔戚血蓝蛋白(mcKLH)是高质量形式的KLH，从海水养殖生长的帽贝中获得，其免疫原性与KLH相似，但作为于生产抗半抗原抗体的载体蛋白，具有更高的稳定性和效率。每个mcKLH分子可偶联多个抗原分子，以此提升抗原免疫原性，提高免疫动物针对目标表位产生高滴度抗血清的概率，同时mcKLH具有高分子质量（ 4.5×10⁵至 1.3×10⁷ 道尔顿；350和 390 kDa 亚基聚集体），可引发比BSA或OVA更强的免疫应答。因此常作为载体蛋白，与半抗原、弱免疫原偶联，用于动物免疫制备特异性抗体。

本试剂盒采用EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）杂双功能交联剂实现半抗原与载体蛋白偶联，所得偶联物可刺激机体产生免疫应答，制备靶向半抗原的抗体。EDC能够与半抗原表面暴露的羧基、氨基发生反应，形成稳定化学键。试剂盒包含mcKLH以及适配碳二亚胺反应的专用缓冲液，同时配备脱盐离心柱，仅需简单离心即可实现蛋白的高效回收，每套可支持1次或5次独立偶联反应。 

重要须知

1. 本方案为通用流程，适用于绝大多数半抗原；需根据半抗原分子量、空间结构优化条件以提升偶联效率。

2. 体系中半抗原摩尔量过量可保证偶联充分；通常半抗原与mcKLH等质量投料即可实现摩尔过量。

3. 反应体系出现沉淀属于正常现象，原因为半抗原与载体蛋白偶联过度；减少EDC用量可减轻沉淀。

4. 反应体系添加过DMSO时，平衡柱子的纯化缓冲液需加入同等比例DMSO，避免脱盐过程蛋白析出。

5. 若偶联反应出现沉淀：离心收集上清单独纯化，沉淀留存；纯化完成后将沉淀与纯化液合并使用。

6. 纯化填料建议一次性使用。

7. 在正式实验前，需将试剂恢复至室温，在使用前将试剂进行离心，较低的温度和离心管壁试剂残留均会影响偶联效果；

8. 操作过程中，务必穿戴实验服、一次性手套及防护装备；

9. 所有产品仅限于研究用途。

使用说明

1. 配制mcKLH溶液（10 mg/mL）：向mcKLH中加入200 μL偶联缓冲液，配制成10 mg/mL mcKLH溶液。

2. 制备半抗原溶液（5 mg/mL）：取2 mg半抗原，溶于400 μL偶联缓冲液。

注意：部分半抗原水溶性差，可用DMSO助溶，DMSO在终反应体系中占比＜30%；过高浓度DMSO会造成mcKLH不可逆变性。

3. 将400 μL半抗原溶液全部加入到200 μL mcKLH溶液中，混匀得到半抗原-mcKLH混合液。

4. 向一管EDC中加1 mL纯水，立即取50 µL EDC溶液加入到半抗原-mcKLH混合液中，轻轻混匀。室温孵育2小时。

注意：反应进行期间，可提前进行步骤5的操作，完成脱盐柱的平衡。

5. 脱盐柱预平衡

5.1 将一个空的离心柱放入一个 15 mL 收集管中。

5.2 通过反复倒置试剂瓶重悬纯化树脂填料。然后取3.0 mL悬液加入柱中，让树脂沉降。让柱缓冲液依靠重力从柱中排出。初始时，可能需要施加一些压力使最初的几滴缓冲液流出。以1000 × g离心柱子2分钟，弃去储存缓冲液，将柱子放回同一个收集管中。

注意：纯化树脂以20%乙醇的悬液形式提供，树脂与乙醇的体积比为3:1(v/v)。

5.3 向脱盐柱树脂顶部加入2 mL PBS，1000×g离心2分钟，弃去流出液；

注意：若偶联物短期1周内使用：可使用PBS完成脱盐；如需冻存，必须使用试剂盒配套的纯化缓冲液，可避免冻融过程蛋白失活析出

5.4 重复步骤5.3两次，第三次洗涤时加入PBS，直到进入下一步骤时再进行离心；

注意：使用定角转子时，在柱子背对转子中心的一侧做标记。在后续所有离心步骤中，将柱子放入离心机时，标记面应背对转子中心。

5.5 第三次洗涤离心后，脱盐柱中应无溶液残留，如有残留，可短暂离心直至溶液完全排出；

6. 偶联物脱盐纯化

6.1 将准备好的脱盐柱放入新的15 mL离心管中，并将步骤4中的全部样品加入脱盐柱中；

注意：若反应出现沉淀，离心收集上清单独纯化，沉淀留存；纯化完成后将沉淀与纯化液合并使用。

6.2 脱盐柱1000 × g离心2分钟，收集管中的即为纯化偶联物。

7. 保存

7.1 纯化后可直接用于动物免疫；若存放超过数日，无菌过滤后置于无菌容器，4℃短期保存或分装-20℃冻存。