细胞泛素化免疫荧光(IF)检测试剂盒

产品介绍

泛素(Ub)介导的蛋白质翻译后修饰是核心调控通路，几乎参与全部细胞生理活动。除经典的介导蛋白降解功能外，现有研究证实泛素还参与细胞信号传导、DNA 损伤应答、蛋白胞内转运、细胞周期调控、炎症反应、免疫应答及细胞凋亡调控。 泛素修饰依靠异肽键完成，泛素C端与靶蛋白赖氨酸残基的ε-氨基共价结合，该过程称为泛素化修饰。泛素自身含7个赖氨酸位点(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)，任意赖氨酸均可连接新的泛素分子，形成多聚泛素链。不同赖氨酸连接型泛素链赋予泛素系统多样化细胞调控功能。研究最透彻的两类泛素链为 K48、K63 连接型：K48多聚泛素链主要介导靶蛋白经蛋白酶体降解；K63多聚泛素链调控蛋白功能、亚细胞定位与蛋白互作。大量研究证明 K11型泛素链参与细胞有丝分裂调控，未来针对该链型的研究规模将逐步比肩K48、K63。随着更多链型与疾病、特异性细胞通路的关联被报道，其余稀有泛素链的研究热度将快速上升。泛素修饰是动态可逆过程。E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶协同催化蛋白发生单泛素化或多聚泛素化；而去泛素化酶(DUBs)可移除蛋白上单/多聚泛素链、水解泛素链。

本试剂盒专为细胞或组织样本中泛素化蛋白的分布与水平检测而开发，采用高特异性泛素识别探针，结合荧光成像技术，可直观、灵敏地反映样本中泛素化蛋白的定位与相对丰度。

产品特点

1. 高灵敏度与特异性：采用高亲和力特异性靶向泛素化蛋白，即使在低丰度样本中也能准确捕捉泛素化信号，非特异性结合背景极低。

2. 操作简便：提供即用型工作液，减少配制步骤，简化实验流程。

3. 稳定性强：经严格质量控制，批次间性能一致，数据重复性好。

4. 广泛适用性：兼容细胞爬片、组织切片等多种样本类型，适配荧光显微镜及共聚焦显微镜。

检测原理

本试剂盒基于泛素识别探针与样本中泛素化蛋白的特异性结合。探针共价偶联近红外荧光染料Cy5(激发/发射波长：647 nm/665 nm)，其优势在于背景荧光低、光稳定性良好，尤其适合细胞与组织成像。当探针结合靶标后，在647 nm波长激发下发射665 nm荧光信号，从而直观显示泛素化蛋白的亚细胞定位与相对丰度。试剂盒提供的细胞核染色试剂（激发/发射波长：350 nm/460 nm）可透过细胞膜，选择性结合DNA双链，呈现明亮蓝色荧光，用于辅助定位细胞核及评估细胞状态。染色后样本可于荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。 

使用方法
注：固定液、通透液、洗涤液、封闭液、 抗荧光淬灭封片液，在使用前需完全恢复至室温后方可加样；所有含荧光探针、细胞核染色试剂、封片液的孵育步骤全程避光操作，建议使用锡箔包裹湿盒避光孵育。
1. 对于贴壁细胞：
1.1 细胞培养生长至约50%-70%融合度。吸弃培养液，用PBS洗涤1-2次。
1.2 加入足量固定液完全覆盖细胞表面，室温固定 10-30 min；参考用量：6 孔板 1 mL/孔，96 孔板 100 μL/孔。
1.3 小心吸除固定液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
1.4 加入足量通透液(6 孔板1 mL/孔)，室温通透15分钟。最佳通透时间需根据细胞类型进行优化。
1.5 小心吸除通透液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
1.6 加入足量封闭液 (6 孔板1 mL/孔)，室温封闭1小时。
1.7 无需弃去封闭液，按体系终稀释比例 1:500-1:1000 加入Cy5标记的检测探针，4 ℃避光湿盒孵育过夜。提示：若追求更低背景、更强特异性信号，可弃去封闭液并洗涤 1 次后再加探针。
1.8 小心吸出检测探针，用洗涤液洗涤3-5次，每次5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
1.9 加入细胞核染色试剂，室温避光染色5-10分钟(6 孔板1 mL/孔)。
1.10 吸除细胞核染色液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完时吸尽洗涤液。
1.11 成像处理：6 孔板 / 细胞爬片：滴加适量抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片(避免气泡)，避光静置后荧光显微镜下镜检；96 孔板：可保留少量洗涤液直接上机成像，需快速完成拍摄避免荧光衰减。
2. 对于悬浮细胞：
2.1 收集细胞悬液于离心管中，500×g离心5分钟，小心吸弃上清，用PBS洗涤1-2次。
2.2 加入固定液重悬，室温固定10-30分钟。500×g离心5分钟，小心吸弃固定液，洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
2.3 加入通透液重悬，室温通透15分钟。500×g离心5分钟，小心吸弃通透液，洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。最佳通透时间需根据细胞类型进行优化。
2.4 加入封闭液重悬，室温封闭1小时。
2.5 无需弃去封闭液，按体系终稀释比例 1:500-1:1000 加入Cy5标记的检测探针，4 ℃避光湿盒孵育过夜。提示：若追求更低背景、更强特异性信号，可弃去封闭液并洗涤1次后再加探针。 500×g离心5分钟，小心吸弃探针液，洗涤液洗涤3~5次，每次3-5分钟。
2.6 加入细胞核染色液重悬，室温避光染色5-10分钟。500×g离心5分钟，小心吸弃细胞核染色液，洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
2.7 将细胞重悬于适量PBS中，滴加至载玻片上，轻柔吹匀，自然微干后滴加适量的抗荧光淬灭封片液，封片(避免气泡)后避光镜检。
3. 对于组织切片：
3.1 对于石蜡切片先进行常规的二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化处理后，需进行抗原修复(推荐微波热修复法，于柠檬酸钠缓冲液或EDTA缓冲液中加热至95-100°C，维持10-20分钟)，冷却至室温后再从固定步骤开始操作。
3.2 对于冷冻切片取出恢复至室温后，PBS充分漂洗去除OCT包埋剂后，直接进行后续固定步骤。
3.3 后续固定、通透、封闭、探针孵育、核染、洗涤、封片流程同贴壁细胞操作规范。
注意事项
1. 试剂回温：固定液、通透液、洗涤液、封闭液、 抗荧光淬灭封片液，在使用前需完全恢复至室温后再进行加样操作，低温试剂直接接触样本易造成细胞皱缩、背景升高。
2. 避光操作：所有涉及荧光探针、细胞核染色液及封片液的步骤均需避光操作，荧光染料见光易淬灭，建议使用锡箔纸包裹或在不透光的湿盒中进行孵育。
3. 对照设置：每次实验需设置阴性对照和阳性对照，以排除假阳性、试剂自发荧光干扰。
4. 安全操作：固定液含多聚甲醛，具有毒性，请在通风橱中操作并佩戴防护用品。细胞核染色液有腐蚀和对人体有潜在危害，操作时请戴手套。
5. 防止干片：洗涤和孵育过程中，务必保持样品湿润，避免干片导致高背景或脱片。